周婷婷 鄭小曼 歐陽凈 魯雁秋 陳耀凱

結核病是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染所引起的一種傳染性疾病，是全球十大死因之一，2020年全球新發(fā)結核病患者987萬例，發(fā)病率為127/10萬[1]。結核病治療和管理在全球范圍內(nèi)面臨著MTB多藥耐藥日益嚴峻的挑戰(zhàn)。作為煙酰胺的一種衍生物，吡嗪酰胺自1952年被發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性后就一直被用于結核病的治療，具有不可替代的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺被動擴散進入MTB胞內(nèi)后，在吡嗪酰胺酶作用下活化為吡嗪酸，當MTB所處環(huán)境為低pH值條件時會促進吡嗪酸在菌內(nèi)的累積，聚集的吡嗪酸破壞了胞內(nèi)正常的酸堿平衡從而導致細胞死亡，表現(xiàn)為吡嗪酰胺的抗菌作用[2]。吡嗪酰胺在降低結核病復發(fā)率、縮短病程，以及治療異煙肼和利福平耐藥患者方面都發(fā)揮關鍵作用[3]。此外，在體外低pH值條件下，其他一線抗結核藥物效果不佳時，吡嗪酰胺仍對半休眠期MTB和持留菌具有較好的殺菌作用[4]。

然而，越來越多研究表明，MTB對吡嗪酰胺的耐藥性呈明顯上升趨勢[5]，其耐藥性主要是由于一些靶標基因突變產(chǎn)生的，包括編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因、編碼30S核糖體蛋白質(zhì)S1的rpsA基因、編碼天門冬氨酸脫羧酶的panD基因等。另外，部分研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型脂肪酸合成酶FAS-I基因突變、長鏈脂酰輔酶A連接酶D2編碼基因fadD2突變與MTB對吡嗪酰胺的耐藥性也存在一定聯(lián)系。筆者結合最新文獻，對幾種可能與吡嗪酰胺耐藥性相關的靶標基因及其研究進展進行綜述。

一、吡嗪酰胺耐藥相關基因及其機制

(一)pncA

pncA基因長558 bp，編碼186個氨基酸，最終轉錄翻譯為吡嗪酰胺酶。在MTB對吡嗪酰胺耐藥有關的基因突變中，pncA基因突變種類最豐富且位點不固定，包括大部分的點突變和少數(shù)的堿基插入或缺失突變，部分菌株中pncA在不止一個位點均有突變。因此，pncA突變也被認為是MTB對吡嗪酰胺耐藥的分子基礎[6]。Yadon等[7]在體外實驗和動物模型中對MTB的pncA突變進行了篩選，發(fā)現(xiàn)了300多個pncA突變，這些突變導致吡嗪酰胺酶活性損失或吡嗪酰胺酶蛋白質(zhì)豐度降低；Li等[8]利用大腸桿菌pncA基因敲除菌株測試了30個新發(fā)現(xiàn)的pncA突變對吡嗪酰胺酶活性的影響，結果表明，這些新突變中的24個導致吡嗪酰胺酶的活性喪失。這些研究都表明，pncA的突變使吡嗪酰胺在細胞內(nèi)轉變成有活性的吡嗪酸效率受損，進而使該菌株具有吡嗪酰胺耐藥性。

Ei等[9]對192株MTB進行吡嗪酰胺藥物敏感性試驗和pncA測序分析，在82株分離株的pncA啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)65個不同的突變。Naluyange等[10]報道了K96R、T142R、R154G和V180F的突變，這些pncA的突變均使MTB表現(xiàn)出對吡嗪酰胺的耐藥性，而吡嗪酰胺敏感菌株的測序結果則顯示pncA及啟動子區(qū)均未發(fā)生突變；Wu等[11]在一些中國耐藥株中發(fā)現(xiàn)pncA基因一些位點的突變率超過5%，這些突變位點包括第10位谷氨酰胺(Gln)突變?yōu)楦彼?Pro)，第12位天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楸彼?Ala)，第41位酪氨酸(Tyr)突變?yōu)榻K止子，第97位甘氨酸(Gly)突變?yōu)樘於彼?Asp)，第128位纈氨酸(Val)突變?yōu)楦拾彼?Gly)和第131位FSC的突變。

雖然pncA基因突變的位點幾乎無規(guī)律可尋，分散于整個基因范圍內(nèi)，但Katale等[12]研究發(fā)現(xiàn)，有42.1%的突變發(fā)生在第128位，表現(xiàn)為纈氨酸(Val)突變?yōu)楦拾彼?Gly)。Aggarwal等[13]發(fā)現(xiàn)由pncA突變引起的吡嗪酰胺酶突變結構(W68R，W68G)和天然吡嗪酰胺酶蛋白相比，與底物的親和力更低，分子動力學模擬分析表明，吡嗪酰胺酶第68個殘基突變會導致其活性位點發(fā)生結構變化，進而影響蛋白質(zhì)的生物學功能，即吡嗪酰胺向吡嗪酸的轉化，表現(xiàn)為MTB的吡嗪酰胺抗性。

(二)rpsA

rpsA基因全長1446 bp，編碼的30S核糖體蛋白質(zhì)S1(RpsA)含有481個氨基酸。rpsA的突變率介于pncA和panD之間，是吡嗪酰胺耐藥基因突變第二大高發(fā)基因[14]。RpsA是一種重要的參與核糖體轉錄和蛋白質(zhì)翻譯過程的蛋白質(zhì)。Shi等[15]認為吡嗪酸的新靶標是RpsA，即吡嗪酸與RpsA結合并與RpsA的天然輔助因子tmRNA競爭，從而抑制活性蛋白質(zhì)合成所需要的反式翻譯，影響MTB的活性蛋白合成，進而達到殺菌作用。之后，該研究者對1株缺乏pncA突變的吡嗪酰胺低水平耐藥MTB臨床分離株DHM444(最低抑菌濃度為200～300 mg/ml 吡嗪酰胺)的rpsA基因進行了序列測定，發(fā)現(xiàn)其在RpsA蛋白的C末端含有DA438缺失，進一步高效表達并純化了突變體RpsA DA438蛋白，發(fā)現(xiàn)與野生型H37Rv RpsA蛋白不同，它不與吡嗪酸結合；對不同分枝桿菌菌種RpsA蛋白序列進行比對，結果顯示，耐吡嗪酰胺的DHM444菌株中DA438缺失發(fā)生的C-末端區(qū)域也是吡嗪酰胺敏感菌株和耐藥菌株間差異最大的區(qū)域，表明該區(qū)域的變化可能改變吡嗪酰胺的易感性[15]。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺對翻譯過程的抑制可能會干擾MTB在應激、脅迫條件下的存活能力。這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋不同應激條件下，如酸性pH值、低氧、饑餓、存在能量抑制劑和其他藥物，都可增強吡嗪酰胺的滅菌活性；也有助于解釋吡嗪酸與RpsA結合并抑制反式翻譯過程[15]。

然而，Dillon等[16]的研究則提出MTB中的活性RpsA與RNA單鏈相互作用，并非是吡嗪酸的靶標。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，一些在吡嗪酰胺抗性菌株中發(fā)現(xiàn)的rpsA突變株，在實驗室進行菌株中重建時并不會表現(xiàn)出吡嗪酰胺抗性；利用純化的MTB核糖體進行體外反轉錄實驗時發(fā)現(xiàn)一種干擾寡核苷酸可以抑制菌體反轉錄，而吡嗪酸卻不能?；谶@些實驗，Dillon等[16]認為吡嗪酰胺在MTB中的作用機制與RpsA和MTB自身的轉錄翻譯無關。Vallejos-Sanchez等[17]也認為RpsA可能不參與MTB中吡嗪酰胺的作用機制，他們評估了吡嗪酸與tmRNA競爭RpsA的能力，結果顯示吡嗪酸和RpsA無論是在MTB野生型還是rpsA突變株中都沒有觀測到相關結合，表明RpsA可能不參與MTB中吡嗪酰胺的作用機制。

(三)panD

panD基因全長420 bp，轉錄翻譯成吡嗪酸的靶標——139個氨基酸組成的天冬氨酸脫羧酶PanD[18]。泛酸和輔酶A(CoA)是MTB正常生理代謝所不可或缺的，panD參與泛酸和CoA生物合成前體β-丙氨酸的合成[19]，由此推測panD突變可能會影響泛酸和CoA的生物合成，進而影響MTB對吡嗪酰胺的敏感性。Shi等[20]對一些在pncA和rpsA中沒有突變的吡嗪酸抗性突變體進行測序分析，發(fā)現(xiàn)吡嗪酸抗性突變體均具有影響panD蛋白C末端的突變，其中PanD M117I是最常見的突變。過表達PanD M117I會賦予MTB對吡嗪酸和吡嗪酰胺的抗性。此外，在治療濃度下，吡嗪酸的濃度與MTB中PanD酶的活性呈負相關，但前藥吡嗪酰胺或吡嗪酰胺類似物煙酰胺并未抑制其活性。這些發(fā)現(xiàn)也同樣表明PanD可能是吡嗪酰胺/吡嗪酸的新靶標[20]。

近期也有報道指出吡嗪酸可能只是一種微弱的PanD酶抑制劑。Gopal等[21]通過圓二色譜分析發(fā)現(xiàn)吡嗪酸可以改變PanD的二級結構和四級結構，他們進一步指出PanD是酪蛋白水解酶ClpC1-ClpP的底物，吡嗪酸通過促進ClpC1-ClpP降解其靶標PanD來阻止MTB正常CoA的生物合成，從而表現(xiàn)為吡嗪酰胺通過降解目標蛋白質(zhì)發(fā)揮抗菌活性。最近的分子動力學研究發(fā)現(xiàn)，PanD酶在其活性位點上以一種競爭性抑制的方式結合吡嗪酸，但PanD酶活性位點不能直接結合抑制劑，而panD突變導致PanD酶蛋白質(zhì)構象發(fā)生變化，促進PanD酶活性位點與吡嗪酸結合進而使菌株產(chǎn)生耐藥，這些耐藥突變多聚集在PanD酶活性部位上方的環(huán)附近，這些抗性突變體通常會表現(xiàn)出較低耐藥性[22]。Pandey等[23]研究發(fā)現(xiàn)，panD基因非活性位點H21R、I49V的突變會造成MTB對吡嗪酰胺耐藥，該研究通過分子動力學模擬，證實了H21R-I49V的雙突變影響了PanD與吡嗪酰胺復合體的結構，與天然蛋白相比，雙突變體對吡嗪酰胺的結合親和力更低、在配體結合位點上結構變化更多，表明panD基因非活性位點突變可能也與MTB的耐藥機制相關。

(四) 其他基因

fadD2基因長1683 bp，編碼長鏈脂肪酸酰輔酶A連接酶(FadD2)。研究報道，fadD2功能的正常發(fā)揮可能有助于MTB對吡嗪酰胺和吡嗪酸表現(xiàn)出耐藥性，F(xiàn)adD2功能喪失可將MTB對吡嗪酰胺和吡嗪酸的敏感性增強16倍，表明fadD2基因可能是MTB天然攜帶的而非后天突變獲得的耐藥基因[24]。值得注意的是，該報道還發(fā)現(xiàn)FadD2功能缺失的突變體在中性pH條件(pH=6.8)下對吡嗪酰胺敏感，而在相同條件下觀察到野生型MTB卻對吡嗪酰胺的高度耐受[24]。從機制上講，fadD2表達中斷引起的脂質(zhì)代謝紊亂可能使MTB在轉錄水平上進行某種程度的代謝重編程，這一發(fā)現(xiàn)同時也提示，吡嗪酰胺的作用機制可能不是完全依賴酸性環(huán)境的[24]。雖然目前大多認為fadD2基因與MTB中CoA和脂質(zhì)代謝聯(lián)系密切，但仍缺乏大量研究以確定fadD2具體如何調(diào)控MTB的吡嗪酰胺耐藥機制。

FAS-I基因編碼脂肪酸合成酶I(FAS-I)，后者是α6亞型的蛋白質(zhì)復合物，由6條長多肽鏈組成，總相對分子質(zhì)量約為2 000 000。每個FAS-I的α鏈有7個催化結構域，由3069個氨基酸組成。FAS-I不僅調(diào)控MTB的脂肪酸合成代謝，也是MTB毒性的關鍵酶復合體[25]。Elad等[25]利用分子建模和單粒子冷凍電鏡技術發(fā)現(xiàn)，盡管FAS-I總體結構相似，但MTB的FAS-I具有與其他細菌FAS-I系統(tǒng)靜電勢不同且結構域之間的間隙更大。FAS-I產(chǎn)生的C26脂肪酸是構成MTB自身重要耐藥細胞膜屏障——分枝菌酸的前體物質(zhì)，考慮到靶向抑制分枝菌酸的合成是一種有效殺滅MTB的方法，因此，F(xiàn)AS-I基因是抗結核藥物的研究主要靶點之一。當吡嗪酸在MTB內(nèi)聚集時會抑制FAS-I的活性進而破壞細胞膜的正常點位、影響菌體的能量代謝，從而發(fā)揮對MTB一定程度上的抑制性[26]。有研究發(fā)現(xiàn)吡嗪酸的類似物5-氯吡嗪酰胺是NADPH與FAS-I結合的競爭性抑制劑，能夠抑制FAS-I的活性[27]。

二、總結與展望

隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，對于MTB的吡嗪酰胺耐藥性相關分子機制的研究也突飛猛進。結合分子動力學分析MTB相關蛋白質(zhì)空間結構、活性位點的變化也大大提升了相關基因耐藥機制的研究水平。近期研究發(fā)現(xiàn)，在吡嗪酰胺耐藥株中大多數(shù)為pncA突變，突變率約為90%，其次為rpsA，突變率約為7%～10%，最后為panD突變，突變率約為1%～3%[28]。雖然相關耐藥分子機制的探索一直在不斷進行當中，但無論是pncA、rpsA、panD、fadD2還是FAS-I，目前尚無任何一個相關耐藥基因的分子機制能夠被完全闡述清楚，且rpsA和panD是否與MTB的吡嗪酰胺耐藥性有明顯相關性目前仍存在一些爭議。關于FAS-I基因突變、fadD2基因突變的研究較少，因此上述相關基因都還需要大量的實驗數(shù)據(jù)支撐以繼續(xù)探究。另外，有些菌株基因測序結果顯示無相關耐藥基因突變，但仍可表現(xiàn)出一定的抗性[29]，部分耐藥基因不同位點的突變所導致的MTB的耐藥性也不相同[8]，這些現(xiàn)象從一定程度上提示MTB對吡嗪酰胺的耐藥還存在一些其他機制或未知的基因突變有待深入研究。

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