蔣 鋒 劉偉杰 陳青春 張姿麗 孫 偉 劉鵬飛*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣州 510225;2.廣州市花都區(qū)獅嶺鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，廣州 510326)

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本的生產(chǎn)資料，也是植物生命周期的基本組成部分，儲(chǔ)存著下一代所需的全部遺傳信息[1]。種子質(zhì)量的高低直接影響著良種特性的發(fā)揮，關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的豐歉[2]。種子貯藏就是使用一定的貯藏設(shè)備和貯藏技術(shù)，有效地保持種子質(zhì)量，從而保證種子的種用價(jià)值。提升種子的耐貯藏性對(duì)保持種子質(zhì)量、保存和利用種質(zhì)資源、延長(zhǎng)種子的使用周期具有重要意義[3]。

種子耐貯藏性除受貯藏環(huán)境條件的制約外，同時(shí)還受其生理指標(biāo)和遺傳特性的影響[4-6]。調(diào)節(jié)種子貯藏環(huán)境如低溫貯藏、超低溫貯藏、超干貯藏、真空貯藏，可有效地延長(zhǎng)種子壽命，延緩種子老化進(jìn)程，增強(qiáng)種子耐貯藏性[3]。生理指標(biāo)研究表明，種子內(nèi)脂肪氧化酶活性、抗氧化酶活性和非酶類抗氧化物質(zhì)含量等與種子耐貯藏性顯著相關(guān)[7-15]。脂肪氧化酶可以與磷脂中的不飽和脂肪酸反應(yīng)，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性、完整性和透性，導(dǎo)致細(xì)胞液滲漏，最終引起種子活力逐步喪失[7-10]。已有研究表明過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GSHPX)等抗氧化酶可以清除種子在貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧和自由基，增強(qiáng)種子的耐貯藏性[11-13]。此外，維生素C和E等非酶類抗氧化物質(zhì)可防止脂質(zhì)過(guò)氧化、清除活性氧，從而增強(qiáng)種子的耐貯藏性[14-15]。從遺傳特性方面說(shuō)，種子耐貯藏性是一個(gè)受多種因素影響的綜合性的數(shù)量性狀，對(duì)其進(jìn)行遺傳分析比較困難。然而，隨著基因組作圖技術(shù)的迅速發(fā)展，數(shù)量性狀基因座(QTL)分析技術(shù)為研究種子耐貯藏性遺傳提供了有力的工具[16]。已有研究通過(guò)自然老化和人工老化試驗(yàn)，對(duì)水稻[17]、小麥[18]、玉米[1,19-20]、大麥[21]、油菜[22]、擬南芥[23]和大豆[24]種子耐貯藏相關(guān)性狀進(jìn)行了QTL定位分析。

人工老化是采用高溫、高濕處理種子，加速種子活力的喪失；自然老化是指種子在自然儲(chǔ)藏的環(huán)境條件下逐漸喪失活力。人工老化可縮短老化時(shí)間，克服了自然老化所需時(shí)間較長(zhǎng)的限制；自然老化試驗(yàn)周期長(zhǎng)，但因符合種子貯藏的自然特性，更能反映種子貯藏實(shí)際[2]。人工老化和自然老化屬于不同的基因調(diào)控系統(tǒng)[16]。因此,只有通過(guò)自然老化的方法,分析與挖掘耐儲(chǔ)藏相關(guān)基因,才能更準(zhǔn)確地了解其遺傳機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)科研成果的實(shí)際應(yīng)用?，F(xiàn)有對(duì)玉米耐貯藏性QTL定位的研究多基于人工老化試驗(yàn)[1,19-20]。通過(guò)自然老化試驗(yàn)對(duì)玉米耐貯藏相關(guān)基因挖掘定位的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬以2個(gè)耐貯藏性差異顯著的糯玉米自交系N7和N32為研究對(duì)象，應(yīng)用BSA群體分離分析法(Bulked segregant analysis)，以雜交組合N7×N32的216個(gè)F2單株為作圖群體，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并以各單株果穗種子儲(chǔ)藏2年后的單位質(zhì)量電導(dǎo)率和發(fā)芽率作為耐儲(chǔ)藏性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)，用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測(cè)耐貯藏相關(guān)QTL，以期為耐貯藏相關(guān)QTL精細(xì)定位、圖位克隆和標(biāo)記輔助選擇耐貯藏新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親本材料

試驗(yàn)親本材料N7(母本)和N32(父本)是廣東省鮮食玉米遺傳育種工程技術(shù)研究中心選育而成的鮮食型糯玉米自交系。經(jīng)多年試驗(yàn)鑒定，兩親本自交授粉后45 d收獲的種子活力和發(fā)芽率均無(wú)顯著差異，室溫儲(chǔ)藏1年以上，N32的種子活力與發(fā)芽率均顯著高于N7。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2016年春季，種植親本自交系N7(不耐儲(chǔ)藏)和N32(耐儲(chǔ)藏)。配制雜交組合N7×N32，同時(shí)兩親本自交，收獲兩親本及F1種子。

2016年12月底，在海南九所新村種植雜交組合N7×N32 的F1，自交獲得F2種子。

2017年春季，同時(shí)種植兩親本、F1和F2。提取兩親本、F1和F2各單株葉片基因組DNA；各世代單株套袋自交授粉，于授粉后45 d收獲果穗，風(fēng)干脫粒，每單株果穗種子隨機(jī)數(shù)取100粒裝袋封口儲(chǔ)藏，記錄種子袋編號(hào)。

2017年8月—2019年8月，216個(gè)F2單株果穗種子室溫儲(chǔ)藏2年。

1.3 耐貯藏相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)獲取

2019年8月，從封口袋中取出種子，將F2每一果穗上的100粒種子用去離子水清洗后分成2份，每份50粒分別稱重，分別放入裝有250 mL去離子水的杯子中，蓋上杯蓋浸泡24小時(shí)后，用電導(dǎo)率儀測(cè)得電導(dǎo)率，得出2個(gè)重復(fù)的電導(dǎo)率均值。

由于電導(dǎo)率與種子活力成負(fù)相關(guān)，將216個(gè)F2電導(dǎo)率數(shù)據(jù)進(jìn)行線性轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法是：用216個(gè)電導(dǎo)率的最大值減去各F2單株的電導(dǎo)率，然后再歸一化到0～100。經(jīng)轉(zhuǎn)化后的數(shù)值作為第一個(gè)耐貯藏性狀值。

測(cè)得種子電導(dǎo)率后將同一果穗上的100粒種子，置于發(fā)芽盒，沙床28 ℃發(fā)芽，7 d后數(shù)出正常幼苗數(shù)，算出發(fā)芽率作為第二個(gè)耐貯藏性狀值。

1.4 極端DNA池的組成

從216個(gè)F2果穗種子中挑選出單位質(zhì)量電導(dǎo)率最小的20個(gè)，記錄編號(hào)；同時(shí)挑出發(fā)芽率最高的20個(gè)，記錄編號(hào)；將編號(hào)相同的種子對(duì)應(yīng)的16個(gè)DNA混合組成極端耐儲(chǔ)藏DNA池。挑出單位種子質(zhì)量電導(dǎo)率最大的20個(gè)，同時(shí)挑出發(fā)芽率最低的20個(gè)，混合編號(hào)相同的種子對(duì)應(yīng)的16個(gè)DNA組成極端不耐儲(chǔ)藏DNA池。

1.5 DNA分子標(biāo)記分析

采用CTAB法[25]提取DNA。據(jù)趙茂俊等[26]、Wang等[27]、于永濤等[28]、劉宗華等[29]和李永祥等[30]已發(fā)表過(guò)的玉米連鎖遺傳圖譜合成引物，結(jié)合玉米遺傳和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www.maizegdb.org)，選擇分布于玉米10 對(duì)染色體上的 600 對(duì) SSR引物對(duì)2個(gè)極端DNA池進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選。針對(duì)多態(tài)性引物所在的染色體，增加引物，以F2為作圖群體構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜，結(jié)合F2果穗種子的2個(gè)貯藏性狀值掃描耐貯藏相關(guān)QTL。

SSR 引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。參照張軍等[31]的PCR 反應(yīng)體系、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色方法進(jìn)行。

1.6 連鎖群構(gòu)建及QTL定位

采用JoinMap 3.0軟件對(duì)216個(gè)F2單株的多態(tài)標(biāo)記基因型進(jìn)行連鎖關(guān)系分析，構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜[32]。采用WinQTLCart2.5軟件，復(fù)合區(qū)間作圖法掃描耐貯藏相關(guān)QTL。LOD(Likelihood of Odd)閾值為3.0。

按照“q+性狀+染色體號(hào)+數(shù)字”命名QTL。性狀以英文縮寫(xiě)表示，如電導(dǎo)率QTL以CE(Converted electroconductibility)表示，發(fā)芽率QTL以GP(Germination percentage)表示。同一條染色體上的各QTL以數(shù)字表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F2耐貯藏相關(guān)性狀的參數(shù)統(tǒng)計(jì)

貯藏2年后，N7和N32果穗種子的單位質(zhì)量電導(dǎo)率(CE)分別為(7.64±4.1)μS/(cm·g)和(93.4±3.3)μS/(cm·g)，兩親本差異極顯著；N7的發(fā)芽率(GP)平均值為(70.0±0.8)%，N32的發(fā)芽率平均值為(86.9±1.0)%，兩親本差異極顯著。

216個(gè)F2果穗種子的CE(圖1(a))和GP(圖1(b))分布見(jiàn)圖1。由兩親本和F2的CE和GP值算得CE的遺傳方差為538.9 (μS/(cm·g))2，環(huán)境方差為13.9 (μS/(cm·g))2；GP的遺傳方差為23.1(%)2，環(huán)境方差為0.8(%)2，2個(gè)耐貯藏指標(biāo)的遺傳方差均>環(huán)境方差，適合作QTL定位分析。

圖1 216個(gè)F2單株種子貯藏2年后單位質(zhì)量電導(dǎo)率及發(fā)芽率分布Fig.1 Distribution of converted electroconductibility (a)and germination percentage (b)after 2 years storage in 216 F2 individuals

2.2 DNA混池間多態(tài)性標(biāo)記篩選

用600對(duì)玉米SSR引物在耐儲(chǔ)藏DNA池和不耐貯藏DNA池之間進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，發(fā)現(xiàn)位于第4號(hào)染色體上的引物umc1284和位于第6號(hào)染色體上的bnlg2097在混合DNA池間存在差異。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

在第4和6染色體上分別設(shè)計(jì)100對(duì)SSR引物，并在親本間篩選其中的多態(tài)性標(biāo)記。以雜交組合N7×N32的F2為作圖群體，利用Joinmap3.0軟件構(gòu)建玉米第4和第6染色體的分子標(biāo)記連鎖圖，結(jié)果見(jiàn)圖2?？芍涸诘?染色體的連鎖圖的長(zhǎng)度為113.68 cM，含有18個(gè)SSR分子標(biāo)記；在第6染色體的連鎖圖的長(zhǎng)度為121.24 cM，包含21個(gè)SSR分子標(biāo)記。

黑色矩形區(qū)域和須狀線區(qū)域分別代表1-LOD置信區(qū)間和2-LOD置信區(qū)間。Bars and whiskers indicate 1-LOD and 2-LOD QTL likelihood intervals,respectively.圖2 遺傳連鎖圖譜及耐貯藏相關(guān)QTL分布Fig.2 Genetic linkage map and storability related QTL distribution

2.4 耐貯藏相關(guān)QTL定位分析

2.4.1電導(dǎo)率的QTL定位

結(jié)合216 個(gè)F2果穗種子的CE和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，用WinQTLCart 2.5軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法在第4和6染色體上掃描QTL，結(jié)果見(jiàn)圖2。在第4染色體上定位到1個(gè)QTL(qCE-4-1)，位于分子標(biāo)記bnlg1265～bnlg1755，加性效應(yīng)為-18.96，顯性效應(yīng)為3.58，貢獻(xiàn)率是30.5%(表1)，LOD值為19.3(圖3)；第6染色體上定位到2個(gè)電導(dǎo)率QTL(qCE-6-1、qCE-6-2)，分別位于umc1014～bnlg1154和phi077～bnlg2097，加性效應(yīng)分別為-10.41和12.10，顯性效應(yīng)分別為11.35和20.85，可分別解釋15.0%和5.4%的表型變異(表1)，LOD值分別為11.2和4.7(圖3)。

2.4.2發(fā)芽率的QTL定位

分子標(biāo)記數(shù)據(jù)結(jié)合F2果穗種子的發(fā)芽率，采用復(fù)合區(qū)間作圖法在第4和6染色體上檢索QTL。結(jié)果顯示，在第4染色體上定位到1個(gè)QTL(qGP-4-1)，位于標(biāo)記區(qū)間bnlg1265～bnlg1755上，加性效應(yīng)為-3.63，顯性效應(yīng)為0.73，貢獻(xiàn)率是25.9%(表1)，LOD值為18.1(圖3)。第6染色體上定位到3個(gè)QTL(qGP-6-1、qGP-6-2、qGP-6-3)分別定位于umc1014～bnlg1154、bnlg1154～umc1614和umc1127～umc1248上，加性效應(yīng)分別為-2.41、-2.73和-1.31，顯性效應(yīng)分別為0.40、1.91和1.46，可分別解釋10.3%、8.2%和4.6%的表型變異(表1)，LOD值分別為8.2、5.6和3.4(圖3)。

圖3 耐貯藏相關(guān)性狀LOD值在連鎖群上的分布Fig.3 LOD distribution of storability related traits in linkage

表1 復(fù)合區(qū)間作圖檢測(cè)到的耐貯藏相關(guān)QTLTable 1 Storability related QTL with the method of CIM

3 討 論

作物種子耐貯藏相關(guān)QTL定位研究主要集中在水稻、小麥、擬南芥上，對(duì)玉米種子的耐貯藏性相關(guān)QTL的研究報(bào)道不多。Wu等[19]對(duì)148個(gè)甜玉米BC4F3單株進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，結(jié)合人工老化后測(cè)得的4個(gè)發(fā)芽性狀指標(biāo)，定位到18個(gè)耐貯藏相關(guān)QTL。其中qGR10在第10染色體上，在2季實(shí)驗(yàn)中均被檢測(cè)到。Han等[20]用8個(gè)人工老化處理，在2個(gè)有共同父本的重組自交系群體里檢測(cè)到4個(gè)穩(wěn)定的主效耐貯藏QTL，分別位于第2、3和5染色體上。Wang等[1]用多種人工老化處理，在重組自交系群體和永久F2群體中同時(shí)定位到一個(gè)穩(wěn)定的主效耐貯藏QTL(qGP5)，位于第5染色體bin5.01上。本研究，通過(guò)測(cè)定自然老化的糯玉米種子的2個(gè)耐貯藏指標(biāo)，應(yīng)用連鎖分析的方法在F2群體中檢索到7個(gè)耐貯藏相關(guān)QTL，分別位于第4和6染色體上。

Tanksley[33]指出，貢獻(xiàn)率>10%的QTL可視為主效QTL。本研究在第4染色體標(biāo)記區(qū)間bnlg1265～bnlg1755內(nèi)同時(shí)定位到電導(dǎo)率和發(fā)芽率2個(gè)指標(biāo)的QTL(qCE-4-1和qGP-4-1)，LOD值分別為19.3和18.1，貢獻(xiàn)率分別為30.5%和25.9%，表明在bnlg1265～bnlg1755標(biāo)記區(qū)間內(nèi)可能存在1個(gè)穩(wěn)定的主效耐貯藏QTL。同時(shí)，在第6染色體umc1014～bnlg1154內(nèi)同時(shí)定位到電導(dǎo)率和發(fā)芽率2個(gè)指標(biāo)的QTL(qCE-6-1和qGP-6-1)，LOD值分別為11.2和8.2，貢獻(xiàn)率分別為15.0%和10.3%，表明在第6染色體umc1014～bnlg1154區(qū)間內(nèi)可能也存在1個(gè)穩(wěn)定的主效耐貯藏QTL。后期將通過(guò)擴(kuò)大群體、加大標(biāo)記密度對(duì)主效耐貯藏QTL進(jìn)行精細(xì)定位，找到可用于輔助選擇的分子標(biāo)記，以期應(yīng)用于育種實(shí)踐。

4 結(jié) 論

本研究以糯玉米組合N7×N32的F2為作圖群體，應(yīng)用BSA方法，以自然老化后種子電導(dǎo)率和發(fā)芽率為耐貯藏指標(biāo)，在第4和6染色體上定位到7個(gè)耐貯藏相關(guān)QTL。其中，在第4染色體bnlg1265～bnlg1755和第6染色體umc1014～bnlg1154內(nèi)分別定位到2個(gè)穩(wěn)定的耐貯藏指標(biāo)主效QTL。