程海燕，沈哲

紹興第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 紹興 312000

克羅恩?。–rohn’s disease, CD）是一種可累及全消化道的慢性、反復(fù)發(fā)作和非特異性炎癥性疾病，其病變多見(jiàn)于末端回腸及其鄰近的結(jié)腸[1]，同時(shí)該病還常伴有皮膚、結(jié)節(jié)性紅斑及關(guān)節(jié)等部位的腸外表現(xiàn)。英夫利昔單抗是治療重度CD最早的一種生物制劑，其安全性和有效性已被證實(shí)[2]，C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）是臨床上評(píng)估治療有效性的常用指標(biāo)。盡管如此，CD的治療及療效評(píng)價(jià)仍有很多不足，需進(jìn)一步研究CD的發(fā)病機(jī)制。有研究表明血管生成參與整個(gè)CD疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（vascular endothelial growth factor, VEGF-A）在此過(guò)程中起重要作用[3]。當(dāng)腸道黏膜受到缺氧、炎癥等刺激后，腸道內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及活化的血小板產(chǎn)生大量的VEGF-A[4-5]。本研究主要檢測(cè)CD患者接受英夫利昔單抗治療后血清及病變腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)水平的變化。

1 資料和方法

1.1 患者資料 收集2016年1月至2020年9月紹興第二醫(yī)院消化內(nèi)科收治的30例重度CD患者。英夫利昔單抗（商品名：類(lèi)克，西安楊森公司）的治療劑量為5 mg/kg，在治療前及治療后6個(gè)月進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)觀察，全部患者診斷符合2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組推薦的標(biāo)準(zhǔn)[6]。同期選擇30例健康志愿者正常結(jié)腸黏膜標(biāo)本及其外周血作為正常對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡12～70歲；②CD活動(dòng)指數(shù)＞450，且隨訪超過(guò)6個(gè)月的患者；③治療前告知英夫利昔單抗的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①資料不完整；②妊娠；③英夫利昔單抗治療＜6個(gè)月。同期選擇30例健康志愿者正常結(jié)腸黏膜標(biāo)本及其外周血作為正常對(duì)照組。本研究納入對(duì)象均簽署知情同意書(shū)并取得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：首次給患者予英夫利昔單抗5 mg/kg，然后在首次給藥后的第2周和第6周及以后每隔8周各給予一次相同的劑量，給藥途徑為靜脈微泵注射。

1.2.2 療效評(píng)定：①顯效：腹痛腹脹等臨床癥狀消失，CRP、ESR下降到正常范圍，腸鏡檢查提示腸黏膜潰瘍愈合，腸糜爛消失。②有效：腹痛腹脹等臨床癥狀消失，CRP、ESR下降，但仍高于正常范圍，腸鏡檢查提示腸黏膜潰瘍縮小，腸糜爛減輕。③無(wú)效：腹痛腹脹等臨床癥狀無(wú)明顯減輕，CRP、ESR下降不明顯，腸鏡檢查提示腸黏膜潰瘍及腸糜爛無(wú)好轉(zhuǎn)，甚至加重。總體有效率=（顯效人數(shù)+有效人數(shù)）/總?cè)藬?shù)×100%。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）：分別抽取每位CD患者治療前、治療6個(gè)月后，及每位健康志愿者的靜脈血，置于促凝管中自然凝固后，1 000×g離心10 min，取血清保存于-80 ℃冰箱待檢。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ELISA操作，用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492 nm）OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算血清樣本中VEGF-A含量。

1.2.4 散射光比濁法及魏氏法：分別抽取每位CD患者治療前、治療6個(gè)月后，及每位健康志愿者的靜脈血，予乙二胺四乙酸抗凝，散射光比濁法檢測(cè)CRP，魏氏法檢測(cè)ESR。該檢測(cè)結(jié)果由我院檢驗(yàn)科提供。

1.2.5 免疫組化染色：每位CD患者治療前后分別取內(nèi)鏡活檢病變腸黏膜標(biāo)本2塊，內(nèi)鏡下取每位健康志愿者正常腸黏膜2塊，40%甲醛固定后石蠟包埋，全部石蠟標(biāo)本均行5 mm連續(xù)切片，放置在60 ℃恒溫箱中烘烤120 min，常規(guī)脫蠟，水化，3%甲醇過(guò)氧化氫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min重復(fù)2次，EDTA修復(fù)，正常羊血清室溫下封閉，加入即用型鼠抗人VEGF-A單抗，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS清洗，加入二抗，溫育0.5 h，沖洗后DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹(shù)膠封片。

1.2.6 結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比＜25%記l分，26%～50%記2分，＞50%記3分；弱染色至中染色記1～4分，強(qiáng)染色記5分；將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分的乘積作為該切片的評(píng)分值，1～4分判定為低表達(dá)（+～++），≥5分判定為高表達(dá)（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻率、百分比表示，多組比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效評(píng)定 30例CD患者經(jīng)英夫利昔單抗治療6個(gè)月后，總體有效率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 CD患者治療6個(gè)月后療效評(píng)定（n=30）

2.2 血清VEGF-A、CRP、ESR水平比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與治療前組比，治療后組血清VEGF-A、CRP、ESR水平明顯下降（P＜0.001）；治療后組血清VEGF-A、CRP高于正常對(duì)照組比，但ESR水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.521）。見(jiàn)表2。

表2 3組CD患者血清VEGF-A、CRP、ESR水平比較（每組n=30，±s）

表2 3組CD患者血清VEGF-A、CRP、ESR水平比較（每組n=30，±s）

與治療前組比：aP＜0.05；與正常對(duì)照組比：bP＜0.05

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2.3 腸道黏膜VEGF-A的表達(dá)強(qiáng)度比較 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，組間腸黏膜VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.39，P＜0.001）；治療后組CD患者腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度明顯低于治療前組（χ2=21.70，P＜0.001），治療后組高于正常對(duì)照組（χ2=5.82，P=0.016）。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 3組腸黏膜VEGF-A表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果（×200）

表3 3組腸黏膜組織VEGF-A表達(dá)比較[每組n=30，例（%）]

2.4 CD患者血清VEGF-A表達(dá)水平與CRP、ESR的相關(guān)性 治療前組CD患者VEGF-A水平與CRP之間呈正相關(guān)（r=0.727，P＜0.001），與ESR之間呈正相關(guān)（r=0.450，P=0.013）；治療后組VEGF-A水平與CRP之間無(wú)相關(guān)性（r=0.158，P=0.405），與ESR之間不相關(guān)（r=0.172，P=0.363）。見(jiàn)圖2。

圖2 CD患者治療前后血清VEGF-A分別與CRP、ESR相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.5 CD患者血清VEGF-A表達(dá)水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性 治療前CD患者血清VEGF-A表達(dá)水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.714，P＜0.001），治療后CD患者血清VEGF-A表達(dá)水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度亦呈正相關(guān)（r=0.926，P＜0.001）。見(jiàn)圖3。

圖3 CD治療前后血清VEGF-A與腸黏膜VEGF-A相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

大量臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗誘導(dǎo)CD緩解、對(duì)腸黏膜愈合及肛瘺管的愈合效果良好，能有效提高患者生活質(zhì)量[7]。近年來(lái)有研究表明CD與免疫應(yīng)答異常有關(guān)[8-9]，英夫利昔單抗是人工合成的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）抗體，可以與TNF-α結(jié)合并中和血漿中的 TNF-α，從而阻斷免疫反應(yīng)的相關(guān)環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)疾病緩解，降低激素的使用劑量，有利于瘺管閉合，可促進(jìn)黏膜修復(fù)。CD除了與免疫應(yīng)答異常有關(guān)，還有研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥與VEGF-A密切相關(guān)。如ALGABA等[10]研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠受累的炎性腸段中，黏膜下血管數(shù)量增多，并檢測(cè)到VEGF-A及其受體高表達(dá)；SCALDAFERRI等[11]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎的小鼠中，抑制VEGF-A表達(dá)對(duì)改善小鼠腸道癥狀明顯有效，同時(shí)能抑制黏膜炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生；TOLSTANOVA等[12]通過(guò)研究3種實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型，均發(fā)現(xiàn)抗血管生成因子內(nèi)皮他丁對(duì)病變鼠的腸道有保護(hù)作用。在臨床研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者的血清和血漿中，VEGF-A的表達(dá)水平均明顯升高，并且檢測(cè)到其受體VEGF-1的表達(dá)也增加[13]。STRUNK等[14]發(fā)現(xiàn)銀屑病和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者用英夫利昔單抗治療后能顯著降低血清中VEGF-A的表達(dá)水平。

為此，本研究探討CD患者通過(guò)英夫利昔單抗治療后是否也存在VEGF-A的表達(dá)水平的改變，治療前后表達(dá)量發(fā)生改變的VEGF-A是否能作為評(píng)估CD治療有效性的指標(biāo)。本研究結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)，30例CD患者經(jīng)英夫利昔單抗治療6個(gè)月后，從腹痛腹脹等臨床癥狀的緩解，到CRP、ESR化驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的下降，再到腸鏡下黏膜愈合情況的總體有效率均高達(dá)75%以上。這與陳白莉等[15]研究發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗在治療中-重度潰瘍性結(jié)腸炎8周后的臨床有效率達(dá)64%，黏膜愈合率達(dá)34%結(jié)果相似。其次還發(fā)現(xiàn)，在CD患者治療前，患者血清中及病變腸道組織VEGF-A的表達(dá)水平相對(duì)較高，經(jīng)英夫利昔單抗治療6個(gè)月后，患者血清及病變腸道組織VEGF-A的表達(dá)水平明顯下降，提示英夫利昔單抗能顯著降低血清及腸道黏膜中的VEGF-A水平，可推測(cè)阻斷VEGF-A調(diào)節(jié)血管生成的通路有利于炎性反應(yīng)的緩解。與健康對(duì)照組比，治療后組血清中VEGF-A表達(dá)水平明顯升高。與治療后組比，CD治療前血清及腸道黏膜中的VEGF-A水平明顯升高，可推測(cè)VEGF-A參與了CD的發(fā)生、發(fā)展。近年來(lái)研究認(rèn)為CRP、ESR對(duì)CD的治療效果有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值[16]，本研究發(fā)現(xiàn)，CD患者接受英夫利昔單抗治療后血清CRP及ESR表達(dá)水平均較治療前明顯下降，提示本研究入選患者經(jīng)英夫利昔單抗治療后是有效的。同時(shí)本研究對(duì)CD患者的血清VEGFA表達(dá)水平與CRP、ESR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CD患者治療前組VEGF-A水平與CRP之間呈正相關(guān)，與ESR之間也呈正相關(guān)，說(shuō)明血清VEGF-A水平隨CD病情加重呈正相關(guān)，這與DI SABATINO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CD患者經(jīng)有效治療后VEGF-A水平明顯下降的結(jié)果一致。CD患者血清VEGF-A表達(dá)水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD患者治療前血清VEGF-A表達(dá)水平與治療前腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，CD患者治療后血清VEGF-A表達(dá)水平與治療后腸道黏膜組織VEGF-A表達(dá)強(qiáng)度也呈正相關(guān)。由此可推出治療前后發(fā)生改變的VEGF-A可能是評(píng)估CD療效的指標(biāo)。盡管目前對(duì)于VEGF-A信號(hào)通路的作用機(jī)制尚不清楚，但本研究推測(cè)阻斷VEGF-A信號(hào)通路將是治療CD的潛在靶點(diǎn)以及VEGF-A有可能作為一個(gè)評(píng)估療效的指標(biāo)，進(jìn)一步研究VEGF-A信號(hào)通路將有利于對(duì)CD發(fā)病機(jī)制更深入的探索。