陶春平

(常州新東化工發(fā)展有限公司，江蘇 常州 213034)

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PD)是一種重要的化工原料，可作為有機(jī)溶劑應(yīng)用于潤(rùn)滑油、染料、油墨、抗凍劑等行業(yè)，尤其可作為單體應(yīng)用于新型聚酯材料聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的合成。PTT具有許多獨(dú)特的性質(zhì)：尼龍樣的彈性恢復(fù)、良好的著色性、抗紫外線、抗靜電等，受到研究者的廣泛關(guān)注，從而促進(jìn)了其合成單體1,3-PD的研究和開發(fā)[1]。為了角逐PTT的巨大市場(chǎng)，DuPont和Shell兩家跨國(guó)公司曾采用化學(xué)合成路線，以環(huán)氧乙烷或丙烯醛為原料生產(chǎn)1,3-PD。但化學(xué)合成路線需要高溫高壓、設(shè)備投資巨大且合成的1,3-PD的羰基含量高，直接導(dǎo)致長(zhǎng)期以來1,3-PD來源受限，從而限制了PTT的發(fā)展。為此，DuPont公司開發(fā)了一條生物合成路線，以谷物來源的葡萄糖為底物，通過基因工程改造的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD，在全球范圍內(nèi)形成了技術(shù)壟斷和專利封鎖[2]，目前僅在美國(guó)本土生產(chǎn)1,3-PD，再將其作為原料出口至世界其它國(guó)家和地區(qū)。

為了打破DuPont公司的壟斷，各國(guó)科學(xué)家積極尋找DuPont公司的生物合成替代路線，人們發(fā)現(xiàn)，自然界中存在一些細(xì)菌可以利用甘油為底物合成1,3-PD，這些細(xì)菌包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等[3]；同時(shí)，隨著生物柴油產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，其副產(chǎn)的甘油可以為這些細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD提供足夠底物，因此，這種利用甘油為底物生物合成1,3-PD的路線具有較好的開發(fā)前景，得到了較多的關(guān)注。然而這些細(xì)菌在以甘油為底物合成1,3-PD的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，如乙醇、乳酸、丁二酸、乙酸等，這些副產(chǎn)物的存在一方面降低了甘油轉(zhuǎn)化率，同時(shí)還會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[4]。因此，作者選擇K.pneumoniaeATCC 25955為原始菌株，利用代謝工程手段對(duì)K.pneumoniae生物合成1,3-PD的副產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控，以提高K.pneumoniae生物合成1,3-PD的效率。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與質(zhì)粒

K.pneumoniaeATCC 25955購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，置于甘油管中-80 ℃冰箱保藏，該菌株具有對(duì)氧氣不敏感的特性而適用于工業(yè)化生產(chǎn)；E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于Vazyme公司，用于質(zhì)粒的構(gòu)建和擴(kuò)增等分子克隆實(shí)驗(yàn)；E.coliS17-1和質(zhì)粒pKR6K均由上海交通大學(xué)許平教授惠贈(zèng)，E.coliS17-1用于擴(kuò)增質(zhì)粒pKR6K并通過接合轉(zhuǎn)移的方式將其轉(zhuǎn)移到K.pneumoniae中，質(zhì)粒pKR6K用于目的基因的敲除和整合；質(zhì)粒pDK7自帶IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子tac，由英國(guó)John Innes Centre的Mike J. Merrick教授惠贈(zèng)，用于在K.pneumoniae中過表達(dá)基因。實(shí)驗(yàn)所涉及的菌株和質(zhì)粒相關(guān)信息見表 1。

表1 菌株與質(zhì)粒

1.2 引物

引物(表2)用于擴(kuò)增目的基因的上下游同源臂，均由金斯瑞生物科技(南京)有限公司合成。

1.3 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基(g·L-1)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加終濃度為20 g·L-1的瓊脂。如有需要，向培養(yǎng)基中添加終濃度為25 μg·mL-1的氯霉素或100 μg·mL-1的氨芐。

(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油20.0，酵母提取物7.0，K2HPO4·3H2O 7.0，KH2PO42.0，(NH4)2SO41.25，MgSO4·7H2O 0.1，微量元素1.0 mL·L-1。微量元素成分包括：CaCl2·2H2O 3.2 mg·L-1，ZnCl23.8 mg·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 30.0 mg·L-1，MnCl2·4H2O 11.14 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.96 mg·L-1，CoCl2·6H2O 2.64 mg·L-1，H3BO30.35 mg·L-1，Na2MoPO4·2H2O 24.5 μg·L-1。用NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH值至7.0。如有需要，向培養(yǎng)基中添加終濃度為20 μg·mL-1的氯霉素。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG。

(3)分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油20.0，酵母提取物1.0，K2HPO4·3H2O 6.0，KH2PO42.0，(NH4)2SO45.0，MgSO4·7H2O 0.32，C6H5Na3O7·2H2O 0.6，微量元素1.0 mL·L-1。微量元素的成分同上。如有需要，向培養(yǎng)基中添加終濃度為20 μg·mL-1的氯霉素。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，添加終濃度為1 mmol·L-1的 IPTG。

(4)LAS培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10，酵母粉5，蔗糖150，瓊脂粉15，115 ℃滅菌20 min。

(5)M9培養(yǎng)基(g·L-1)：5×M9儲(chǔ)存液：Na2HPO4·12H2O 8.5，KH2PO41.5，NaCl 0.25，NH4Cl 0.5；檸檬酸三鈉固體培養(yǎng)基：檸檬酸三鈉0.5，瓊脂粉15；每100 mL檸檬酸三鈉固體培養(yǎng)基中加入20 mL 5×M9儲(chǔ)存液并加入合適濃度的抗生素。上述成分均在121 ℃下滅菌20 min。

1.4 菌種培養(yǎng)

搖瓶培養(yǎng)：將-80 ℃保藏的K.pneumoniaeATCC 25955于LB平板上劃線培養(yǎng)得到單菌落；挑取活化的單菌落接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)12～16 h；然后將種子液轉(zhuǎn)接到50 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)30 h，控制起始OD600值為0.01。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將-80 ℃保藏的K.pneumoniaeATCC 25955于LB平板上劃線培養(yǎng)得到單菌落；挑取活化的單菌落接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)過夜；以1%的接種量轉(zhuǎn)接至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)8～12 h；再以5%的接種量轉(zhuǎn)接至5 L攪拌生物反應(yīng)器(初始裝液量為3 L)中，37 ℃、200 r·min-1進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵。發(fā)酵過程中用4 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，通氣量控制在1 vvm，當(dāng)初始甘油濃度降至2 g·L-1以下時(shí)添加60%的甘油進(jìn)料溶液以保持甘油濃度在20～30 g·L-1范圍內(nèi)。期間，控制甘油進(jìn)料溶液的補(bǔ)充速率，確保甘油濃度每2 h增加3～5 g·L-1。

1.5 分子克隆方法

通過自殺質(zhì)粒同源重組的方式實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除和插入。首先，構(gòu)建具有待敲除基因(Target)上下游同源臂的敲除質(zhì)粒pKR6K-ΔTarget，并經(jīng)過E.coliS17-1以接合轉(zhuǎn)移的方式將其轉(zhuǎn)移到K.pneumoniae胞內(nèi)發(fā)生同源重組，從而達(dá)到敲除目的基因的目的。當(dāng)在pKR6K系列敲除質(zhì)粒的上下游同源臂之間插入相應(yīng)目的基因后，可以相同的方式實(shí)現(xiàn)相應(yīng)目的基因的整合表達(dá)。

在接合轉(zhuǎn)移的過程中，分別吸取5 mLE.coliS17-1(pKR6K-ΔTarget)和1 mLK.pneumoniae菌液，離心并用無菌生理鹽水混勻后滴至固體LB平板中間，正置37 ℃培養(yǎng)過夜；將平板中間菌落用無菌生理鹽水吹打混勻，6 500×g離心5 min，收集菌體，并用4 mL無菌生理鹽水重懸；將重懸液適當(dāng)稀釋后，涂布于含有氯霉素抗性的M9固體培養(yǎng)基上進(jìn)行單交換篩選，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取M9固體培養(yǎng)基上的單菌落，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并得到陽性克隆子；將陽性克隆子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)液稀釋后涂布于LAS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行雙交換篩選；最后，對(duì)目的基因進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，得到目的基因缺失的菌株。表達(dá)質(zhì)粒pDK7通過電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入K.pneumoniae中，并在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)[8]。

用一步組裝試劑盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，Vazyme)實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。首先選擇合適的酶切位點(diǎn)對(duì)載體進(jìn)行線性化，通過引物設(shè)計(jì)軟件(http://www.vazyme.com)設(shè)計(jì)引物，在5′端加上20 bp同源序列，使擴(kuò)增產(chǎn)物之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化克隆載體之間都具有能夠相互同源重組的完全一致的序列。分別定量各片段濃度，并計(jì)算各片段的最適使用量(0.02×片段堿基對(duì)數(shù))。將各片段混合吹打均勻，37 ℃反應(yīng)30 min后降至4 ℃或立即置于冰上冷卻。取10 μL重組產(chǎn)物加入到100 μLE.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。最后，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行菌落PCR，并挑取陽性克隆子提取質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 檢測(cè)方法

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌體的生物量，以發(fā)酵液OD600值表示。發(fā)酵開始后，每隔一定時(shí)間取500 μL發(fā)酵液，10 000×g離心5 min，棄上清；用無菌生理鹽水清洗2遍后重懸，稀釋一定倍數(shù)后測(cè)定OD600值。菌體的細(xì)胞干重(DCW)是以上述方法收集菌體后冷凍干燥至恒重得到。

采用外標(biāo)法繪制各代謝產(chǎn)物及底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)主要代謝產(chǎn)物及底物的含量，包括乳酸、乙醇、丁二酸、1,3-PD、2,3-丁二醇、乙酸和甘油。取不同時(shí)期的發(fā)酵液于10 000×g離心5 min，上清液稀釋一定倍數(shù)后經(jīng)0.22 μm水相尼龍膜過濾，進(jìn)樣檢測(cè)。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad,USA)，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，柱溫65 ℃，流動(dòng)相為5 mmol·L-1硫酸，流速0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 副產(chǎn)物合成途徑缺失菌株的構(gòu)建

通過設(shè)計(jì)pKR6K自殺質(zhì)?？梢詫?shí)現(xiàn)K.pneumoniae基因組中目的基因的靶向敲除，從而阻斷相關(guān)代謝途徑。為了有效提高1,3-PD的產(chǎn)量，首先，嘗試敲除乙醇、乳酸、丁二酸、2,3-丁二醇等副產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵基因，其關(guān)鍵酶的編碼基因分別為adhE、ldhA、frdA、budA，大小分別為2 133 bp、990 bp、1 792 bp、780 bp。然后，分別構(gòu)建能夠用于基因敲除的質(zhì)粒pKR6K-ΔadhE、pKR6K-ΔldhA、pKR6K-ΔfrdA、pKR6K-ΔbudA，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，確定可以用于K.pneumoniae突變菌株的構(gòu)建。將上述質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliS17-1中，并通過接合轉(zhuǎn)移的方式使質(zhì)粒在K.pneumoniae胞內(nèi)與基因組上的目標(biāo)片段進(jìn)行同源重組，依次敲除相關(guān)基因。在得到陽性克隆子后，分別用引物adhE-F和adhE-R1進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增adhE基因，用引物ldhA-F和ldhA-R1進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增ldhA基因，用引物frdA-F和frdA-R1進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增frdA基因，將得到的陽性克隆子命名為Kpr-1。在Kpr-1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)budA基因進(jìn)行敲除,將得到的陽性克隆子命名為Kpr-2。

2.2 副產(chǎn)物合成途徑缺失重組菌株的搖瓶發(fā)酵

為了驗(yàn)證副產(chǎn)物合成途徑缺失對(duì)K.pneumoniae利用甘油合成1,3-PD的影響，對(duì)原始菌株WT、菌株Kpr-1、菌株Kpr-2進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，繪制生長(zhǎng)曲線并測(cè)定主要代謝產(chǎn)物乳酸、乙醇、丁二酸、1,3-PD、2,3-丁二醇、乙酸的含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 原始菌株WT、菌株Kpr-1、菌株Kpr-2的搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線及代謝產(chǎn)物分布Fig.1 Growth curves and metabolite profiles of strains WT,Kpr-1,and Kpr-2 under shake fermentation

由圖1可知：

(1)敲除adhE、ldhA、frdA基因后，乙醇、乳酸、丁二酸的合成途徑缺失，菌株Kpr-1搖瓶發(fā)酵副產(chǎn)物乳酸和乙醇的積累顯著減少，乳酸含量從1.76 g·L-1降至0.22 g·L-1，乙醇含量從1.58 g·L-1降至0 g·L-1，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致；但丁二酸積累變化不明顯，含量?jī)H從0.46 g·L-1降至0.43 g·L-1(圖1b)；目標(biāo)產(chǎn)物1,3-PD含量在發(fā)酵末期能夠達(dá)到13.92 g·L-1，相比原始菌株WT提高了31.0%(圖1c)；乙酸含量明顯升高并呈現(xiàn)持續(xù)積累的趨勢(shì)，在發(fā)酵末期達(dá)到1.33 g·L-1(圖1d)；菌株Kpr-1的生物量明顯減少，僅為原始菌株的88%(圖1a)，這是由于質(zhì)子化的乙酸可以穿過細(xì)胞膜并破壞跨膜pH梯度，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[10]，抑制菌體生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致發(fā)酵停止。由于胞內(nèi)的代謝擾動(dòng)，2,3-丁二醇的含量也有所變化，從4.80 g·L-1升至6.35 g·L-1(圖1c)。這是由于2,3-丁二醇的合成會(huì)受到發(fā)酵過程中pH值的誘導(dǎo)，在酸性條件下，2,3-丁二醇合成途徑會(huì)被激活以抵抗這種逆環(huán)境；在當(dāng)前發(fā)酵過程中，高濃度的乙酸積累不可避免地會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基逐漸酸化，從而促進(jìn)2,3-丁二醇的合成[11]。

(2)在菌株Kpr-1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除budA基因，2,3-丁二醇合成途徑缺失，雖然可以有效降低2,3-丁二醇含量，但是會(huì)嚴(yán)重影響菌株Kpr-2的生物量以及目標(biāo)產(chǎn)物1,3-PD含量。菌株Kpr-2的生物量在發(fā)酵末期僅為菌株Kpr-1的60%，并且提前3 h進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1a)；目標(biāo)產(chǎn)物1,3-PD的含量大幅降低，從13.92 g·L-1降至5.59 g·L-1。究其原因，主要是2,3-丁二醇合成途徑對(duì)于促進(jìn)輔因子NADH的再生以及維持胞內(nèi)pH值穩(wěn)定具有重要作用。據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，在K.pneumoniae阻斷2,3-丁二醇和乳酸合成途徑的同時(shí)會(huì)不可避免地造成酸(特別是丙酮酸)的積累，從而影響菌株的發(fā)酵性能。另外，2,3-丁二醇合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物還參與了支鏈氨基酸的生成，支鏈氨基酸對(duì)于微生物的生長(zhǎng)至關(guān)重要，缺乏這類物質(zhì)必然會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)保留2,3-丁二醇合成途徑，以Kpr-1作為出發(fā)菌株，進(jìn)一步對(duì)乙酸溢流現(xiàn)象進(jìn)行代謝調(diào)控，以進(jìn)一步提高1,3-PD的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。

2.3 乙酸吸收途徑的強(qiáng)化

菌株Kpr-1與原始菌株WT相比具有更高的1,3-PD產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。然而，由于胞內(nèi)代謝流的再分配，導(dǎo)致進(jìn)入乙酸合成途徑的碳通量增加。在K.pneumoniae發(fā)酵過程中乙酸的合成主要通過AK-PTA合成途徑。然而，這條合成途徑對(duì)于調(diào)控菌體胞內(nèi)代謝平衡以及維持菌體生長(zhǎng)具有重要作用，因而無法直接對(duì)其進(jìn)行阻斷。另一方面，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)K.pneumoniae發(fā)酵過程中存在一條能夠回用乙酸的代謝途徑，由乙酰輔酶A合成酶(ACS，由acs基因編碼)催化乙酸回用生成乙酰輔酶A。為了減少乙酸的積累，作者采用強(qiáng)化乙酸吸收途徑的代謝策略，加快乙酸的吸收，緩解乙酸溢流。研究過程中，分別對(duì)來自K.pneumoniae和巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)的acs基因進(jìn)行過表達(dá)，探究了應(yīng)用上述策略對(duì)K.pneumoniae乙酸積累的影響。最后，篩選了更加高效的acs基因進(jìn)行基因組整合表達(dá)，以更好地滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

2.3.1 構(gòu)建乙酰輔酶A合成酶過表達(dá)菌株

為了強(qiáng)化乙酸吸收途徑來解決K.pneumoniae發(fā)酵過程中乙酸溢流的問題，分別構(gòu)建能夠過表達(dá)內(nèi)源乙酰輔酶A合成酶基因(acskp)的質(zhì)粒pDK7-Ppc-acskp和能夠異源過表達(dá)A.pasteurianus來源乙酰輔酶A合成酶基因(acsap)的質(zhì)粒pDK7-Ppc-acsap。用含有氯霉素的抗性平板進(jìn)行陽性克隆子的篩選，獲得能夠更高效催化乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的acs基因。經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，將以上質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方式分別轉(zhuǎn)化到菌株Kpr-1中，構(gòu)建重組菌株Kpr-1-Ppc-acskp、Kpr-1-Ppc-acsap。

為了將Ppc-acsap表達(dá)盒整合到菌株Kpr-1的基因組中進(jìn)行組成型表達(dá)，構(gòu)建質(zhì)粒pKR6K-frdA::Ppc-acsap，并將其通過接合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入菌株Kpr-1中，通過多輪抗性篩選得到陽性克隆子，將其命名為Kpr-3。

2.3.2 乙酸吸收途徑強(qiáng)化重組菌株的搖瓶發(fā)酵

為了探究強(qiáng)化乙酸吸收途徑對(duì)K.pneumoniae利用甘油合成1，3-PD的影響，對(duì)菌株Kpr-1、重組菌株Kpr-1-Ppc-acskp、重組菌株Kpr-1-Ppc-acsap進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，繪制生長(zhǎng)曲線并測(cè)定底物甘油及主要代謝產(chǎn)物1,3-PD、乙酸、2,3-丁二醇、乳酸、乙醇、丁二酸的含量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：

(1)引入acs基因后，重組菌株Kpr-1-Ppc-acskp、Kpr-1-Ppc-acsap的生物量均有所升高，與菌株Kpr-1比較分別提高了13.7%和17.7%(圖2a)；重組菌株的生物量在發(fā)酵開始的12 h內(nèi)要明顯低于菌株Kpr-1。

(2)引入acs基因后，重組菌株的甘油利用速率稍有下降。發(fā)酵6 h時(shí)，菌株Kpr-1的甘油剩余量就低于2株重組菌株；發(fā)酵9 h時(shí)，就能夠完全消耗培養(yǎng)基中的甘油；而重組菌株要在發(fā)酵12 h后才能完全消耗底物甘油(圖2b)。

(3)引入acs基因后，重組菌株的乙酸含量明顯下降，表現(xiàn)出更強(qiáng)的乙酸回用能力。在發(fā)酵0～9 h時(shí)，2株重組菌株積累乙酸的含量較菌株Kpr-1低；發(fā)酵9 h后，乙酸更是被持續(xù)吸收并在發(fā)酵27 h時(shí)被消耗完畢，說明強(qiáng)化乙酸吸收途徑這個(gè)代謝工程策略能夠有效調(diào)控發(fā)酵過程中乙酸的含量。從圖2d可以看出，引入acsap基因的重組菌株Kpr-1-Ppc-acsap表現(xiàn)出更好的乙酸吸收效果。因此，選擇Ppc-acsap表達(dá)盒進(jìn)行基因組整合表達(dá)。隨著乙酸的持續(xù)消耗，重組菌株Kpr-1-Ppc-acskp、Kpr-1-Ppc-acsap的生物量在發(fā)酵12 h后均有所提高；但2株重組菌株的1,3-PD含量在發(fā)酵末期均下降了約11%(圖2c)，推測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物1,3-PD的產(chǎn)量可能與乙酸的生產(chǎn)具有潛在的關(guān)系。

(4)引入acs基因后，2,3-丁二醇和乳酸的含量基本沒有變化(圖2e、f)，碳代謝流在這兩條合成途徑之間保持著一種總量平衡。

(5)值得注意的是，乙酰輔酶A衍生物的產(chǎn)量受到了過表達(dá)acs基因的影響，直觀的表現(xiàn)為發(fā)酵過程中乙醇和丁二酸的含量提高了(圖2g、h)。總之，強(qiáng)化乙酸吸收途徑能夠有效促進(jìn)乙酸回用，減少發(fā)酵過程中乙酸的積累。

圖2 菌株Kpr-1、重組菌株Kpr-1-Ppc-acskp、重組菌株Kpr-1-Ppc-acsap的搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線及代謝產(chǎn)物分布Fig.2 Growth curves and metabolite profiles of strains Kpr-1,Kpr-1-Ppc-acskp,and Kpr-1-Ppc-acsap under shake fermentation

2.3.3 乙酸吸收途徑強(qiáng)化重組菌株的分批補(bǔ)料發(fā)酵

考慮到后續(xù)的產(chǎn)物分離難度及經(jīng)濟(jì)成本，在發(fā)酵過程中應(yīng)避免使用抗生素(用于維持質(zhì)粒穩(wěn)定)、化學(xué)誘導(dǎo)劑(例如IPTG)等價(jià)格昂貴的額外添加劑[13]。將組成型啟動(dòng)子pc控制的Ppc-acsap表達(dá)盒整合到基因組中進(jìn)行表達(dá)能夠有效解決上述問題。為了進(jìn)一步探究重組菌株Kpr-3的發(fā)酵性能，對(duì)該菌株進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵并對(duì)主要代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下，菌株Kpr-3的1,3-PD產(chǎn)量顯著提升，達(dá)到94.9 g·L-1，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到3.16 g·L-1·h-1。值得注意的是，在發(fā)酵末期，乙酸含量相較于菌株Kpr-1下降了17.6%，從10.8 g·L-1降至8.9 g·L-1，表明上述乙酸溢流調(diào)控策略可以有效調(diào)節(jié)K.pneumoniae發(fā)酵過程中乙酸的積累。然而，菌株Kpr-3在發(fā)酵中期(10～18 h)產(chǎn)生了較多的乙酸，可以推斷acs基因的連續(xù)表達(dá)不可避免地增加了乙酰輔酶A的代謝通量，從而激活乙酸合成途徑，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供更多能量，以補(bǔ)償乙酰輔酶A合成酶消耗的ATP。實(shí)際上，內(nèi)源性acs基因的表達(dá)可以響應(yīng)乙酸合成途徑的通量增加和碳限制，從而使其代謝通量上調(diào)[14]。當(dāng)?shù)孜锾急怀掷m(xù)消耗時(shí)，acs基因開始表達(dá)，與此同時(shí)乙酸開始被重新回用。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，分批補(bǔ)料條件下甘油的不斷添加直接導(dǎo)致底物過剩情況出現(xiàn)，此時(shí)乙酸含量又開始提高。根據(jù)理論計(jì)算，乙酸合成途徑對(duì)1,3-PD的合成更為有利[15]。當(dāng)乙酸是甘油代謝的唯一副產(chǎn)物時(shí)，可獲得合成1,3-PD的最大NADH供應(yīng)量[16]。因此，在此階段(10～18 h)，1,3-PD產(chǎn)量明顯提高，并在發(fā)酵20 h后達(dá)到平穩(wěn)。相似的結(jié)論在丁酸梭菌中也有發(fā)現(xiàn)，即1,3-PD的高濃度與有機(jī)酸(乙酸和丁酸)的高濃度有關(guān)[17]。另外，強(qiáng)化乙酸吸收途徑對(duì)乳酸含量的影響幾乎可以忽略不計(jì)。與此同時(shí)，2,3-丁二醇的含量下降了13.4%，為29.0 g·L-1。丁二酸和乙醇的最終含量分別為5.0 g·L-1和0.49 g·L-1，與菌株Kpr-1相似，但菌株Kpr-3在發(fā)酵中期的丁二酸含量明顯提高，推測(cè)這是由于乙酰輔酶A代謝通量增加所致?？傊阴］o酶A合成酶的整合表達(dá)可以有效提高1,3-PD的最終產(chǎn)量。

圖3 菌株Kpr-1(a)和重組菌株Kpr-3(b)分批補(bǔ)料發(fā)酵的代謝產(chǎn)物分布Fig.3 Metabolite profiles of strains Kpr-1(a) and Kpr-3(b) under fed-batch fermentation

3 結(jié)論

利用接合轉(zhuǎn)移的方法，依次敲除了K.pneumoniae代謝甘油產(chǎn)1,3-PD的副產(chǎn)物乙醇、乳酸、丁二酸合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因后，在分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下，1,3-PD的產(chǎn)量達(dá)到83.8 g·L-1，生產(chǎn)強(qiáng)度提至2.79 g·L-1·h-1，底物甘油的轉(zhuǎn)化率能夠達(dá)到0.60 mol/mol，分別提高了9.07%、8.94%及13.46%。然而，胞內(nèi)代謝流再分配導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的積累大幅增加，從4.3 g·L-1增至10.8 g·L-1。為了減少發(fā)酵過程中的乙酸積累，進(jìn)一步構(gòu)建了乙酸吸收途徑強(qiáng)化重組菌株。通過篩選比對(duì)不同來源的乙酰輔酶A合成酶基因(acs)發(fā)現(xiàn)A.pasteurianus來源的acsap基因能夠更高效地催化乙酸合成乙酰輔酶A。將該基因進(jìn)行基因組整合表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與未進(jìn)行乙酸回用強(qiáng)化菌株相比，在分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下，1,3-PD的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了13.24%和13.26%，達(dá)到94.9 g·L-1和3.16 g·L-1·h-1；乙酸含量從10.8 g·L-1降至8.9 g·L-1，下降了17.6%。這表明通過敲除副產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因結(jié)合乙酸吸收途徑強(qiáng)化能夠促進(jìn)1,3-PD的合成以及減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高K.pneumoniae代謝甘油合成1,3-PD的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。