陳立格，王 瑩，蘭 衛(wèi)

(1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830017；2.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000；3.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002)

藥理學研究表明，玫瑰具有廣泛的藥理活性，玫瑰花具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、降糖[3]、抑菌[4]等作用。對玫瑰花的研究主要集中在玫瑰紅色素的提取[5]、花蕾的抗氧化能力[6]、化學成分與質量標準[7]、黃酮類成分的提取及抗氧化性能[8]、降糖作用等方面。小枝玫瑰(branchlet rose)主要生長在新疆和田地區(qū)和喀什地區(qū)，日照時間長，干旱少雨，生長期長，一年開花一次，產量低。小枝玫瑰與內地玫瑰差異較大，主要產品有玫瑰花醬、玫瑰花茶和玫瑰精油，南疆少數民族使用較多，北疆及內地使用較少。目前有關小枝玫瑰化學成分的提取、純化、質量標準及生物活性的研究尚不充分。鑒于此，作者采用大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮，采用紫外可見分光光度法測定小枝玫瑰總黃酮含量，考察大孔樹脂類型、最大上樣量、上樣速度、洗脫劑體積分數、洗脫劑流速、洗脫劑用量對純化效果的影響，對純化工藝進行優(yōu)化，為小枝玫瑰的深入開發(fā)利用提供幫助。

1 實驗

1.1 藥材、試劑與儀器

小枝玫瑰花(批號20170110)，新疆維吾爾藥業(yè)有限公司。經新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院姚藍副教授鑒定為薔薇科植物小枝玫瑰(branchlet rose)的干燥花蕾。

蘆丁標準品(批號20151221)，上海源葉生物科技有限公司；硝酸鋁(批號20160512，分析純)、亞硝酸鈉(批號20160122，分析純)、HPD-600大孔樹脂(批號20150423)、HPD-100大孔樹脂、X-5大孔樹脂(批號20150324)、AB-8大孔樹脂、D101大孔樹脂(批號20150423)，天津永晟精細化工有限公司；氫氧化鈉(批號20150212)、95%乙醇(批號20141203，分析純)，天津風船化學試劑科技有限公司；甲醇(批號20150122，色譜純)，F(xiàn)isher公司；實驗用水均為純水。

UV2700型紫外可見分光光度計，日本島津公司；AS系列超聲波清洗機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；RC-FA系列電子分析天平，北京睿誠永創(chuàng)有限公司；玻璃儀器氣流烘干器、RE-52B型旋轉蒸發(fā)儀，河南鄭州長城科工貿有限公司；ST-02A型中藥粉碎機，浙江永康帥通五金工具有限公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋，金壇醫(yī)療儀器廠；A4001493型微量移液槍，上海(寶山區(qū))艾測電子科技有限公司。

1.2 小枝玫瑰總黃酮的含量測定

采用紫外可見分光光度法測定小枝玫瑰總黃酮含量。首先參照文獻[9]制備標準溶液和供試溶液；取標準溶液和供試溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法顯色[10]，在200～800 nm范圍內進行掃描，發(fā)現(xiàn)標準溶液和供試溶液均在510 nm處有最大吸收，因此，后續(xù)實驗選擇510 nm為測定波長。然后取蘆丁標準品定容，分別吸取0.1 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL蘆丁標準溶液，濃度分別為0.001 18 mg·mL-1、0.011 8 mg·mL-1、0.023 6 mg·mL-1、0.035 4 mg·mL-1、0.047 2 mg·mL-1、0.059 0 mg·mL-1，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法顯色，測定各濃度溶液在510 nm處吸光度，測定3次，取平均值，以吸光度(A)為縱坐標、蘆丁濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線。再取供試溶液，按上述方法測定510 nm處吸光度，依據標準曲線方程計算小枝玫瑰總黃酮含量。

1.3 小枝玫瑰總黃酮的純化工藝優(yōu)化

1.3.1 樣品溶液的制備

準確稱取1.00 g小枝玫瑰花粉末于錐形瓶中，按料液比1∶16(g∶mL，下同)加入50%乙醇，在80 ℃下提取30 min，過濾，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，冷凍干燥制成粉末。然后用50%乙醇配制小枝玫瑰總黃酮含量為0.8 mg·mL-1的樣品溶液。

1.3.2 純化工藝的優(yōu)化

以純化效果為評價指標，通過單因素實驗對大孔樹脂純化工藝條件大孔樹脂類型、最大上樣量、上樣速度、洗脫劑體積分數、洗脫劑流速、洗脫劑用量[11-12]等進行優(yōu)化。

2 結果與討論

2.1 標準曲線方程與線性范圍

按1.2方法測定0.001 18 mg·mL-1、0.011 8 mg·mL-1、0.023 6 mg·mL-1、0.035 4 mg·mL-1、0.047 2 mg·mL-1、0.059 0 mg·mL-1蘆丁標準溶液在510 nm處的吸光度分別為0.004、0.089、0.201、0.318、0.430、0.528。以吸光度(A)為縱坐標、蘆丁濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線，擬合得到線性回歸方程為A=9.2389c-0.0127，R=0.9991，表明，蘆丁濃度在0.001 18～0.059 0 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 大孔樹脂的選擇

通過靜態(tài)吸附-脫附實驗和動態(tài)吸附-脫附實驗考察5種大孔樹脂HPD-600、HPD-100、X-5、AB-8、D101對小枝玫瑰總黃酮的純化效果。大孔樹脂使用前均用95%乙醇浸泡24 h。

靜態(tài)吸附-脫附實驗：準確稱取預處理好的5種大孔樹脂各2.0 g，用濾紙吸干后置于具塞磨口三角瓶中，加入小枝玫瑰總黃酮含量為1.998 mg·mL-1的樣品溶液40 mL，室溫下吸附24 h，取上層液1 mL，定容至10 mL容量瓶中，測定總黃酮含量，按式(1)計算比吸附量(mg·g-1)。然后將上述吸附飽和的大孔樹脂用純水清洗后，加入80%乙醇20 mL，在25 ℃水浴振蕩24 h進行靜態(tài)解吸，按式(2)、(3)計算比解吸量(mg·g-1)及解吸率(%)：

(1)

(2)

(3)

式中：c0為吸附前樣品溶液中總黃酮含量，mg·mL-1；c1為吸附后上層液中總黃酮含量，mg·mL-1；V0為樣品溶液體積，mL；m為大孔樹脂質量，g；c2為洗脫液中總黃酮含量，mg·mL-1；V2為洗脫液體積，mL。

動態(tài)吸附-脫附實驗：取預處理好的5種大孔樹脂，濕法裝柱10 cm；再以95%乙醇清洗，直到流出液澄清為止；然后用純水洗至無醇味；加入小枝玫瑰總黃酮含量為0.1 mg·mL-1的樣品溶液15 mL，用15 mL 95%乙醇洗脫，記錄洗脫液的體積并測定洗脫液中總黃酮含量，按式(4)計算洗脫率(%)：

(4)

5種大孔樹脂HPD-600、HPD-100、X-5、AB-8、D101對小枝玫瑰總黃酮的靜態(tài)吸附-脫附和動態(tài)吸附-脫附效果見表1。

表1 5種大孔樹脂對小枝玫瑰總黃酮的靜態(tài)吸附-脫附和動態(tài)吸附-脫附效果

由表1可知，HPD-600大孔樹脂對小枝玫瑰總黃酮的靜態(tài)吸附效果及解吸效果都比較好；且動態(tài)吸附-脫附實驗所用的洗脫液體積較少、洗脫率高出其它大孔樹脂很多，是小枝玫瑰總黃酮分離純化用較理想的大孔樹脂。因此，后續(xù)實驗選擇HPD-600大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮。

2.3 最大上樣量的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，加入樣品溶液進行動態(tài)吸附實驗。以總黃酮泄漏量為指標，考察上樣量對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響(圖1)：將樣品溶液過柱，分段(每10 mL收集一管)收集流出液，測定其在510 nm處吸光度，計算流出液中總黃酮含量，按式(5)計算總黃酮泄漏量(%)：

圖1 上樣量對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響Fig.1 Effect of sampling amount on purification efficiency of total flavonoids from branchlet rose

(5)

由圖1可知，當上樣量超過270 mL時，流出液中的總黃酮明顯增多，泄漏量明顯增加，說明此時總黃酮開始明顯泄漏。故，選擇小枝玫瑰總黃酮樣品溶液的最大上樣量為270 mL。

2.4 上樣速度的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，分別以不同速度上樣進行動態(tài)吸附實驗。以總黃酮吸附量為指標，考察上樣速度對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結果見表2。按式(6)計算總黃酮吸附量：

表2 上樣速度對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響

吸附量=c0×V0-c2×V2

(6)

由表2可知，上樣速度為1.5 mL·min-1時，小枝玫瑰總黃酮吸附量最大，為148.51 mg。故，選擇上樣速度為1.5 mL·min-1。

2.5 洗脫劑體積分數的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，分別用不同體積分數(30%、40%、50%、60%、70%)的乙醇作為洗脫劑進行動態(tài)吸附-脫附實驗。分段收集洗脫液，稀釋后測定其吸光度，考察洗脫劑體積分數對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結果如圖2所示。

圖2 洗脫劑體積分數對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響Fig.2 Effect of eluent volume fraction on purification efficiency of total flavonoids from branchlet rose

由圖2可知，洗脫劑體積分數對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響較大，40%乙醇的洗脫效果最佳。故，選擇40%乙醇為洗脫劑。

2.6 洗脫劑流速的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，分別以不同流速洗脫進行動態(tài)吸附-脫附實驗。分段收集洗脫液，稀釋后測定其吸光度，以洗脫液中總黃酮質量為指標，考察洗脫劑流速對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結果見表3。

表3 洗脫劑流速對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響

由表3可知，當洗脫劑流速為 0.5 mL·min-1時，洗脫液中總黃酮質量最高，洗脫效果最佳，純化效果最佳。故，選擇洗脫劑流速為 0.5 mL·min-1。

2.7 洗脫劑用量的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速 0.5 mL·min-1，在洗脫劑用量分別為10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL時進行動態(tài)吸附-脫附實驗。分段收集洗脫液，測定其在510 nm處吸光度，以洗脫液中總黃酮質量為指標，考察洗脫劑用量對小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結果見表4。

由表4可知，隨著洗脫劑用量的增加，洗脫液中總黃酮質量迅速降低；當洗脫劑用量為60 mL時，洗脫液中總黃酮質量降至最低。故，選擇洗脫劑用量為60 mL。

2.8 驗證實驗

取小枝玫瑰花粉末2.0 g，按料液比1∶20加入60%乙醇提取60 min；過濾，用蒸餾水稀釋成總黃酮含量為0.8 mg·mL-1的樣品溶液；在上述確定的最優(yōu)條件下進行小枝玫瑰總黃酮的純化：HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速0.5 mL·min-1，洗脫劑用量60 mL。收集洗脫液，水浴烘干，得小枝玫瑰總黃酮純化粉末1.64 g；稱取0.02 g粉末，加入100 mL甲醇攪拌溶解，精密吸取5 mL，定容至25 mL容量瓶中，測定吸光度，計算純化粉末中總黃酮質量，按式(7)計算總黃酮轉移率(%)，結果見表5。

(7)

由表5可知，在最優(yōu)條件下對小枝玫瑰總黃酮進行純化，3次驗證實驗得到的總黃酮轉移率平均值為58.75%。表明，確定的最優(yōu)純化條件可行，純化效果較好。

表5 最優(yōu)純化工藝條件下的驗證實驗結果(n=3)

2.9 討論

靜態(tài)吸附時，HPD-600大孔樹脂對小枝玫瑰總黃酮的吸附優(yōu)于其它型號大孔樹脂，解吸也比其它型號大孔樹脂容易；動態(tài)吸附時，HPD-600大孔樹脂對小枝玫瑰總黃酮的吸附和脫附效果均比其它型號大孔樹脂的要好。本實驗采用HPD-600大孔樹脂對小枝玫瑰乙醇提取物進行純化，在進行多次吸附-脫附純化后，小枝玫瑰總黃酮的純度會降低。因此，在實際生產中應對小枝玫瑰總黃酮粗提物進行預處理，從而延長HPD-600大孔樹脂的使用時間。

3 結論

通過單因素實驗對大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮的工藝條件進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝條件如下：HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，樣液濃度0.8 mg·mL-1，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速0.5 mL·min-1，洗脫劑用量60 mL。在此條件下純化得到的小枝玫瑰總黃酮中的總黃酮含量為23.24%，總黃酮轉移率為58.75%。