史宗勇 劉 璇 路 超 郭俊佩 許冬梅 趙娟麗 袁建琴

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

大豆作為傳統(tǒng)農(nóng)作物，既是重要的食物原料，也是植物油和動(dòng)物飼料蛋白的重要來源。因全球大豆需求旺盛，多年來，大豆一直是轉(zhuǎn)基因品種推廣面積最大的作物。2018年，全球種植轉(zhuǎn)基因大豆9 590萬公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植總面積的50%，占全球大豆種植總面積的78%[1]。國(guó)內(nèi)大豆產(chǎn)量無法滿足市場(chǎng)需求，我國(guó)已成為大豆凈進(jìn)口國(guó)。2019年，我國(guó)進(jìn)口大豆8 851 萬噸，進(jìn)口量遠(yuǎn)超其他作物[2]，且進(jìn)口大豆幾乎均為轉(zhuǎn)基因大豆。轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2由美國(guó)孟山都公司研發(fā)，運(yùn)用基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)入cp4-epsps具有抗除草劑性狀，我國(guó)批準(zhǔn)其進(jìn)口用作加工原料。然而，轉(zhuǎn)基因作物自誕生以來，其安全性一直備受爭(zhēng)議。因此，探究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)動(dòng)物的潛在影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

全世界各國(guó)均制定了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)體系。我國(guó)主要從分子特征、環(huán)境安全和食用安全3個(gè)方面對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行安全評(píng)價(jià)[3]。其中，食用安全性評(píng)價(jià)主要圍繞營(yíng)養(yǎng)成分分析和營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)、致敏性評(píng)價(jià)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)展開[4]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外常用不同轉(zhuǎn)基因材料飼喂大鼠[5-6]、小鼠[7]、羅非魚[8]、山羊[9]等模型動(dòng)物，研究動(dòng)物體重增長(zhǎng)、飼料利用率、臟器系數(shù)、血常規(guī)、血清化學(xué)、重要器官結(jié)構(gòu)變化，多數(shù)研究認(rèn)為喂食轉(zhuǎn)基因飼料未對(duì)測(cè)試動(dòng)物產(chǎn)生顯著影響。睪酮作為哺乳動(dòng)物最重要的雄性激素，由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，在雄性動(dòng)物精子生成、性行為維持中發(fā)揮重要作用。睪丸間質(zhì)細(xì)胞中睪酮的生物合成和分泌與葡萄糖攝取密切相關(guān)[10]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-8(glucose transporter 8,GLUT8)是重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體。提高該基因的表達(dá)水平，能增強(qiáng)細(xì)胞攝取葡萄糖的能力，增加睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成與分泌[11]。轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)影響研究主要集中在睪丸臟器系數(shù)、組織結(jié)構(gòu)、生殖細(xì)胞和精子形態(tài)等方面[12-14]，鮮見其對(duì)雄性大鼠睪酮分泌的研究報(bào)道。本試驗(yàn)以長(zhǎng)期喂食含有轉(zhuǎn)基因大豆(GTS40-3-2)飼料的親代大鼠繁殖獲得子代大鼠，斷乳后繼續(xù)飼喂相同飼料，對(duì)喂食過程中子代雄鼠生長(zhǎng)狀況、主要器官發(fā)育和雄性激素睪酮合成必需蛋白GLUT8表達(dá)的影響進(jìn)行測(cè)試，以探討轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)子代雄性大鼠器官和生殖機(jī)能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 親代30日齡健康SD大鼠購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK(晉)2015001)，其中雄性大鼠60只，雌性大鼠30只，按體重隨機(jī)分為兩組。條件為溫度22～26℃，濕度50%～65%，12 h光照、12 h黑暗籠養(yǎng)，普通環(huán)境飼喂，取食、飲水自由。

試驗(yàn)組(GM組)喂食含轉(zhuǎn)基因大豆(GTS40-3-2大豆)飼料，對(duì)照組(CK組)喂食含常規(guī)大豆(Soy-bean A5403大豆)飼料，試驗(yàn)大豆材料由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(太原)提供。Soy-bean A5403大豆是轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的轉(zhuǎn)化受體。組內(nèi)雌雄分籠飼喂90 d后，同組雌雄大鼠交配，交配期、孕期及哺乳期各組母鼠繼續(xù)給予相應(yīng)飼料飼喂。

子代大鼠母乳喂養(yǎng)21 d后，各組每窩隨機(jī)至多抽取2只雄性仔鼠，每組16只，各組子代大鼠繼續(xù)喂食與親本大鼠相同飼料，飼喂30、60、90 d后，各組分別隨機(jī)選取5只大鼠用于本研究。

1.1.2 飼料 飼喂飼料委托山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工，飼料根據(jù)大鼠常規(guī)飼料配方為基礎(chǔ)配制(其中豆粕含量為20%)[15]，GM組飼料中豆粕全部為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2豆粕，CK組飼料中全部為Soy-bean A5403大豆豆粕。兩種飼料除豆粕成分外其他成分一致，飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分符合《GB 14924.3-2010 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》[16]要求。

1.1.3 主要儀器 IQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；ELx808型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Neofuge 25R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，香港力康發(fā)展有限公司；THUNDER-DM6B正置熒光顯微鏡，德國(guó)萊卡公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)期間，每天早中晚3次觀察并記錄大鼠的飲食飲水、精神狀態(tài)等一般行為活動(dòng)，特別關(guān)注大鼠皮毛、生殖器外觀、糞便及死亡等異常表現(xiàn)。

1.2.1 臟器系數(shù)的測(cè)定 喂食子代大鼠30、60、90 d后，用頸椎脫臼法處死大鼠，稱量體重，剪開體腔解剖，分別摘取睪丸、附睪、腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟和腎上腺，仔細(xì)剔除關(guān)聯(lián)組織后稱重，計(jì)算大鼠主要器官的臟器系數(shù)。

1.2.2 大體解剖及組織學(xué)檢查 解剖時(shí)對(duì)臟器進(jìn)行大體觀察，摘取睪丸、附睪、腎和肺，用解剖剪將其修為5～8 mm的組織塊，用10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水(85%、95%、100%)、二甲苯透明、石蠟包埋后制成6 μm厚組織切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin,HE)封存，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.3GLUT8基因表達(dá)RT-qPCR測(cè)定 采用Trizol法提取大鼠睪丸組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)引物(表1)。按照試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。選用大鼠18SrRNA作為參照基因。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.2.4 GLUT8蛋白酶聯(lián)免疫分析 室溫融化冷凍保存的睪丸組織，用3～5℃預(yù)冷的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗去除組織表面雜質(zhì)。在4℃條件下小心剝除被膜結(jié)構(gòu)，用無菌剪刀將組織剪碎稱重，按1 g組織加入9 mL PBS溶液，勻漿處理形成均勻的組織溶液，3 000 r·min-1離心20 min，取上清分裝，按照大鼠GLUT8酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書操作，反應(yīng)終止后立即用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用GEN5CHS2.01軟件分析處理檢測(cè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠重要器官臟器系數(shù)的影響

由表2可知，飼喂期間兩組大鼠睪丸、附睪、腦、心、肺、肝、脾、腎和腎上腺的臟器系數(shù)隨著飼喂天數(shù)的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)。與CK組相比，飼喂30、90 d后9種器官臟器系數(shù)無顯著差異(P>0.05)；飼喂60 d后，睪丸、腦、心、肝、脾、腎和腎上腺的臟器系數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而肺、附睪臟器系數(shù)存在顯著差異(P<0.05)。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)臟器系數(shù)的影響Table 2 Effects of GM soybeans on visceral coefficents of rat

2.2 喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠重要器官組織結(jié)構(gòu)的影響

飼喂子代雄性大鼠30、60、90 d后處死，摘取睪丸、附睪、腎臟和肺制做組織切片。鏡檢發(fā)現(xiàn)GM組和CK組各器官結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理改變。

睪丸結(jié)構(gòu)見圖1，生精小管被膜為單層扁平上皮，橫斷面細(xì)胞排列緊密而規(guī)則，管壁可見不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞，且生精細(xì)胞沒有明顯的染色質(zhì)濃縮和斷裂；支持細(xì)胞呈高柱狀，散在分布于各類生精細(xì)胞之間，輪廓依稀可辨；生精小管腔中均有精子存在。

附睪結(jié)構(gòu)見圖2，附睪管結(jié)構(gòu)完整，管周組織含平滑肌細(xì)胞、結(jié)締組織及毛細(xì)血管等結(jié)構(gòu)。附睪管管壁外層基膜完整平滑；內(nèi)層為假復(fù)層纖毛上皮，其中主細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞游離面微絨毛細(xì)長(zhǎng)整齊，形成管腔面刷狀緣；管腔內(nèi)精液飽滿，有大量精子，附睪管結(jié)構(gòu)正常。

腎臟結(jié)構(gòu)見圖3，腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小體清晰可見，斷面為完整的圓形或卵圓形。毛細(xì)血管球位于腎小體中央，結(jié)構(gòu)完好盤曲成簇；毛細(xì)血管管壁有腎小囊臟層包裹，其上足細(xì)胞細(xì)胞核染色清晰；腎小囊腔由臟層和壁層相互移行形成，腎小囊腔明顯，無粘連、膨脹；腎小管管腔輪廓清晰，近端小管管腔較小，管壁上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞游離面可見刷狀緣；遠(yuǎn)端小管腔面規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，核位于細(xì)胞中央或近腔面。

注：1：腎小囊壁層；2：腎小囊腔；3：足細(xì)胞；4：近端小管；5：遠(yuǎn)端小管。Note:1:Wall layer of renal small capsule.2:Renal capsule cavity.3:Podocyte.4:Proximal tubule.5:Distal tubule.圖3 不同時(shí)期的腎組織學(xué)分析(×200)Fig.3 Histopathology analysis of kidney in different periods(×200)

肺結(jié)構(gòu)見圖4，肺組織結(jié)構(gòu)完整，導(dǎo)氣部結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)支氣管界限清晰，管腔清楚無異物；換氣部結(jié)構(gòu)完整，呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管清晰通暢，無肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡上皮細(xì)胞降解、脫落等病理變化現(xiàn)象。

注：1：肺泡管；2：肺泡；3：呼吸性細(xì)支氣管；4：肺泡囊；5：細(xì)支氣管。Note:1:Alveolar duct.2:Alveoli.3:Respiratory bronchioles.4:Alveolar sacs.5:Bronchioles.圖4 不同時(shí)期的肺組織學(xué)分析(×50)Fig.4 Histopathology analysis of lungs in different periods(×50)

2.3 喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠睪丸GLUT8基因表達(dá)的影響

采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCT)分析RT-qPCR數(shù)據(jù)[17]，由圖5-A可知，與CK組相比，GM組大鼠GLUT8基因轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。表明飼料中轉(zhuǎn)基因大豆成分對(duì)子代大鼠睪丸GLUT8基因轉(zhuǎn)錄水平無顯著影響。

為了進(jìn)一步確定GLUT8蛋白的積累量，對(duì)該蛋白進(jìn)行了酶聯(lián)免疫分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品系列數(shù)據(jù)，用GEN5CHS 2.01軟件，獲得線性回歸方程(y=0.475 6x-0.083 6，R2=1)。用該曲線計(jì)算樣品中GLUT8蛋白的含量(圖5-B)，結(jié)果顯示相同飼喂天數(shù)GM組和CK組無顯著差異(P>0.05)，與轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致。表明喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠睪丸中GLUT8蛋白含量無顯著影響。

注：A：轉(zhuǎn)錄水平；B：蛋白水平。Note:A:Transcription level.B:GLUT8 protein level.圖5 轉(zhuǎn)基因大豆成分對(duì)大鼠GLUT8表達(dá)的影響Fig.5 Effect of transgenic soybean components on the expression of GLUT8 in rats

3 討論

3.1 喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠重要器官的影響

動(dòng)物臟器重量、相關(guān)系數(shù)及組織結(jié)構(gòu)的變化能夠體現(xiàn)飼料成分對(duì)臟器的影響，反映動(dòng)物的真實(shí)狀態(tài)，有研究表明轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)動(dòng)物臟器系數(shù)生長(zhǎng)、體重、攝食等方面無不良影響[18-21]，在標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)條件下，解剖可見兩組大鼠主要器官形態(tài)、顏色正常，器官間比例協(xié)調(diào)、大小適中。試驗(yàn)大鼠臟器系數(shù)均隨飼喂天數(shù)的延長(zhǎng)而降低，說明試驗(yàn)期間動(dòng)物體重增長(zhǎng)幅度超過單一臟器的增長(zhǎng)幅度，符合動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，與王堯等[22]報(bào)道結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂30、60、90 d，GM組與CK組大鼠的9種(睪丸、附睪、腦、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺)器官臟器系數(shù)的27組數(shù)據(jù)中，僅飼喂60 d的附睪和肺臟器系數(shù)差異顯著(P<0.05)，但未發(fā)現(xiàn)大鼠肺、附睪增生、水腫、充血或萎縮等退行性改變，且試驗(yàn)所測(cè)臟器系數(shù)數(shù)值均處于董延生等[23]確立的SD雄性大鼠臟器系數(shù)正常參考值(95% CI)范圍內(nèi)。顯著差異可能由動(dòng)物個(gè)體差異或中空管腔樣器官材料處理偏差造成，無生物學(xué)意義。

器官結(jié)構(gòu)是其生理功能正常發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究選擇睪丸、附睪、腎、肺4種器官制作組織切片，鏡檢顯示各器官結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)、分布正常，未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變，表明多代喂食轉(zhuǎn)基因大豆不會(huì)對(duì)子代雄鼠主要器官造成明顯病理損傷。Battistelli等[24]研究表明長(zhǎng)期喂食含轉(zhuǎn)基因大豆飼料不會(huì)導(dǎo)致小鼠消化道上皮結(jié)構(gòu)改變。劉燕等[25]用轉(zhuǎn)基因大豆中作J9331喂養(yǎng)鵪鶉90 d，光鏡下未發(fā)現(xiàn)鵪鶉心、肺等14種器官組織呈現(xiàn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性壞死等不良反應(yīng)。Snell等[26]收集12項(xiàng)長(zhǎng)期研究和12項(xiàng)多代研究數(shù)據(jù)，分析得出長(zhǎng)期飼喂轉(zhuǎn)基因飼料不會(huì)引起動(dòng)物組織器官病理改變。

3.2 喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠生殖機(jī)能的影響

睪丸作為精子生成和雄性激素分泌的場(chǎng)所，是雄性哺乳動(dòng)物最重要的生殖器官，飼料成分對(duì)睪丸結(jié)構(gòu)和功能的影響是轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。蘆春斌等[12-14]研究表明轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)小鼠無不良影響，睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，染色體結(jié)構(gòu)完整，不會(huì)使小鼠的睪丸組織細(xì)胞發(fā)生凋亡和病理損傷，也不會(huì)對(duì)小鼠精子的頂體結(jié)構(gòu)和頂體反應(yīng)能力造成影響。嚴(yán)紅實(shí)等[27]通過精子畸形和骨髓微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗疫霉根腐病轉(zhuǎn)基因大豆B3W1009、抗食葉性害蟲轉(zhuǎn)基因大豆AK8059、高油酸轉(zhuǎn)基因大豆E2D8037和EB8011四種轉(zhuǎn)基因大豆與兩種親本大豆對(duì)精子畸變影響無顯著性差異。Brake等[28]連續(xù)喂食親代大鼠抗草甘膦大豆，檢測(cè)子一代胎鼠、出生后、青春期及成年各階段睪丸發(fā)育情況，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)顯著影響。

本研究針對(duì)雄性動(dòng)物的主要性激素睪酮合成過程的限速因素進(jìn)行研究，從睪酮合成能量供應(yīng)、調(diào)節(jié)因子和原料轉(zhuǎn)運(yùn)三個(gè)維度探討轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)雄鼠睪酮合成的影響，對(duì)試驗(yàn)條件下GLUT8基因的表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在CK組與GM組，各處理時(shí)間組間均無顯著性差異，且轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平結(jié)果一致。蘆春斌等[29]喂食轉(zhuǎn)基因大豆未發(fā)現(xiàn)對(duì)子代雄鼠精子質(zhì)量和組織病理造成影響，與本研究結(jié)果一致。本研究前期發(fā)現(xiàn)飼料中轉(zhuǎn)基因大豆成分對(duì)親代雄性大鼠精子畸變[30]、睪丸結(jié)構(gòu)[31]和類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的表達(dá)[32]均無明顯影響。美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)(US National Research Council)自2002年開始調(diào)查商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物，至今未發(fā)現(xiàn)其對(duì)人類健康和環(huán)境有害[33]。Nicolia等[34]綜合分析全球1 783項(xiàng)轉(zhuǎn)基因作物研究報(bào)告，得出轉(zhuǎn)基因作物對(duì)人類和動(dòng)物無害的結(jié)論。綜合分析表明轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)雄性大鼠生殖機(jī)能無明顯影響。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)子代雄性大鼠持續(xù)喂食轉(zhuǎn)基因大豆飼料，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)大鼠日常生長(zhǎng)發(fā)育、體形外貌、妊娠等生理行為，睪丸、附睪等主要器官系數(shù)、組織結(jié)構(gòu)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄性激素合成能量轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT8的表達(dá)，均未受到飼料中轉(zhuǎn)基因大豆的影響。表明轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分在試驗(yàn)周期內(nèi)對(duì)子代雄性大鼠的主要器官和生殖機(jī)能無不良影響。本研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因大豆食用安全性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)表明轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物育種、種質(zhì)資源改良和保障糧食安全等方面具有重大應(yīng)用價(jià)值。