胡彬華 王 平 杜安平 李 輝 王閔霞 白玉露 冀占東 蒲志剛,*

(1 四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610061；2 中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041；3 三亞市南繁科學技術研究院，海南 三亞 572000)

葉色突變體對研究植物光合作用、葉綠素代謝機制以及葉綠體發(fā)育調(diào)控機理十分重要。植物葉色突變主要有白化、黃化、淡綠、深綠、條紋和斑馬紋等[1]。挖掘和克隆水稻(OryzasativaL.)葉色相關基因并解析其形成機理，有利于水稻高光合效率理論與育種研究，培育高光效優(yōu)良水稻新品種[2]。同時，葉色作為形態(tài)標記可用于育種材料的篩選[3-5]，也可用作觀賞稻和稻田畫制作[6]。研究表明，葉色變異的遺傳機理主要包括細胞核遺傳變異、細胞質(zhì)遺傳變異以及核-質(zhì)互作突變，涉及多個代謝途徑和信號途徑，主要有葉綠素代謝途徑、血紅素代謝途徑、葉綠體發(fā)育調(diào)控途徑、核質(zhì)轉運途徑、類胡蘿卜代謝途徑和嘌呤核苷酸合成途徑等[7-8]。

植物光合器官由于在葉片中積累了葉綠素顯示為綠色。葉綠素合成以谷氨酸作為反應起始物，經(jīng)19步化學反應，涉及18種酶，最后合成葉綠素a和葉綠素b。任意一步反應異常都會導致葉色變異[9]。目前，水稻中已克隆了14個直接參與葉綠素合成的基因[7-8]。自然界中的光合器官能合成兩類四吡咯(tetrapyrroles)：葉綠素(chlorophyll，Chl)和亞鐵血紅素(heme)。血紅素與葉綠素含量之間存在相互抑制[10]；原卟啉(protoporphyrin Ⅸ)是這兩類色素合成的共同中間體。在合成葉綠素分支反應中，Mg-原卟啉Ⅸ螯合酶(Mg螯合酶)催化Mg2+插入原卟啉合成Mg-原卟啉Ⅸ，該反應需要ATP供能，是合成葉綠素反應的第一步，也是葉綠素合成最復雜的一步[11]。而亞鐵螯合酶(ferrochelatase)催化原卟啉的螯合反應是合成亞鐵血紅素分支反應的第一步，該反應不需要ATP供能。Mg螯合酶是由CHLD、CHLH和CHLI組成的異源三聚體，亞鐵螯合酶則是同源二聚體[12]。早期研究表明，只有3個亞基CHLD、CHLH和CHLI按兩步法結合在一起時，Mg螯合酶才具有催化合成葉綠素的活性[10,13-16]。水稻中CHLD、CHLH和CHLI分別編碼水稻Mg螯合酶的3個亞基，其突變體中葉綠素含量降低，表現(xiàn)為水稻黃化或白化[11,17-19]。此外，葉綠素合成途徑中其他關鍵酶基因的突變也會導致葉色變異，如編碼葉綠素合成酶的基因YGL1(yellowgreenleaf1)[20]、編碼鎂原卟啉Ⅸ單酯環(huán)化酶的基因YGL8(yellowgreenleaf8)[21]、編碼聯(lián)乙烯還原酶的基因OsDVR(divinylreductasegene)[22]、編碼鎂原卟啉Ⅸ甲基轉移酶的基因CHLM(Mg-protoporphyrinⅨmethyltransferase)[23]、編碼葉綠素a加氧酶的基因CAO1 (chlorophyllaoxygenase)[24]、編碼糞卟啉原Ⅲ氧化酶的基因RLIN1 (ricelesioninitiation1)[25]、編碼原葉綠素酸酯氧化還原酶B的基因PORB(protochlorophyllideoxidoreductaseB)[26]，這些基因的突變會導致水稻葉片出現(xiàn)黃色轉綠、黃綠色、類病斑和黃白花斑和壞死病斑等表型。

本研究在秈稻骨干恢復系川恢907的60Co-γ輻射誘變突變體庫中篩選到一份淡黃葉突變體pyl3，從苗期開始該突變體整個生育期都表現(xiàn)出淡黃葉表型。本試驗對該突變體的表型特征和主要農(nóng)藝性狀進行鑒定，以及對遺傳分析、基因定位以及葉綠素合成與光合作用相關基因的表達分析等進行研究，旨在為探究葉色變異分子調(diào)控機理和水稻高光效育種應用提供新的材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻淡黃葉突變體paleyellowleafmutant3(pyl3)來源于秈稻恢復系親本川恢907 (R907)的60Co-γ輻射誘變突變庫，經(jīng)回交3代和多代自交后，其淡黃葉表型能穩(wěn)定遺傳。

1.2 葉綠素含量測定

采用Lichtenthaler[27]的方法測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量。取野生型和突變體pyl3植株苗期葉片，液氮研磨，稱取0.2 g樣品粉末，加入95%的乙醇在黑暗中處理48 h后，用Thermo BioMate 3S分光光度計(Thermo Scientific,美國)分別測量470、645和663 nm波長下浸提液的吸光度值，計算葉綠素(chlorophyll，Chl)、葉綠素a(chlorophyll a，Chla)、葉綠素b(chlorophyll b，Chlb)及類胡蘿卜素(carotenoid，Car)含量，每個樣品進行3次生物學重復，結果取平均值。

1.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

在水稻成熟后測定野生型和pyl3突變體的株高、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、粒長、粒寬、千粒重與結實率等主要農(nóng)藝性狀，每個性狀10次重復，并采用t-檢驗法分析突變體與野生型之間的差異顯著性。

1.4 定位群體的構建和遺傳分析

以突變體pyl3為母本，分別與野生型R907和秈稻9311雜交，獲得雜交F1種子；F1植株再自交得到F2種子，分單株收取F2種子進行種植。觀察雜交F1和F2植株葉片的顏色表型并進行遺傳分析；以突變體pyl3和粳稻02428雜交構建的F2群體作為基因定位群體。

1.5 DNA提取和基因定位

在pyl3/02428的F2群體中隨機選取262株淡黃葉表型的單株作為定位植株，采用CTAB法提取葉片DNA[28]。利用分布于12條染色體上，在pyl3突變體與02428之間具有多態(tài)性的簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR)和插入缺失(insertion-deletion,InDel)標記進行初步定位，確定淡黃葉基因的定位區(qū)間。隨后選取F2群體中25個極端黃化單株葉片進行等量混合后提取基因組DNA，同時提取野生型DNA，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組重測序，采用基于BSA全基因組重測序的分析方法進行基因定位[29]。基因定位引物見表1。

1.6 候選基因的分析

BSA基因定位分析以MSU-RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)為參考基因組進行比對分析，在利用分子標記進行基因初步定位結果的基礎上，篩選完全連鎖的候選基因，對候選基因突變位點設計測序引物，在野生型和突變體間進行PCR擴增和測序驗證。引物合成和測序由北京擎科生物工程有限公司成都分公司完成。

1.7 突變位點氨基酸序列比對分析

用水稻CHLI的氨基酸序列在已測序植物數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome.net)中進行比對分析，獲取不同物種中鎂離子螯合酶Ⅰ亞基CHLI的氨基酸序列，篩選與水稻CHLI序列同源度較高的8個物種的氨基酸序列，用DNAMAN7進行比對分析。

1.8 RNA的提取與qRT-PCR

取野生型和pyl3突變體的苗期葉片立即用液氮冷凍研磨，采用Omega(Omega Bio-Tek,美國)植物RNA提取試劑盒(RNeasy plant mini kit)提取葉片總RNA，采用寶生物工程(大連)有限公司的TaKaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)采用KAPA SYBR熒光定量PCR試劑(Kapa Biosystems,美國)，用CFX-96實時熒光定量PCR儀(BioRad，美國)檢測野生型和pyl3突變體中相關基因的表達。以水稻Actin基因作為內(nèi)參基因，每個樣品分別設3次生物學重復和3次技術重復，以2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量，qRT-PCR相關基因引物見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences for this study

2 結果與分析

2.1 pyl3突變體的表型特征及農(nóng)藝性狀分析

與野生型相比，pyl3突變體葉色具有明顯的差異；從苗期起開始pyl3出現(xiàn)明顯的淡黃葉表型，此后在整個發(fā)育過程中都保持淡黃葉表型(圖1-A～C)。成熟后對野生型和突變體進行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計分析，結果顯示，與野生型相比，pyl3突變體的株高、穗長，穗粒數(shù)和結實率分別顯著減少16.29%、14.91%、16.73%、17.93%，有效穗和千粒重無顯著差異(表2)。

表2 野生型和pyl3突變體的主要農(nóng)藝性狀Table 2 The agronomic traits of wild-type (WT)and mutant (pyl3)

圖1 野生型和pyl3突變體在苗期(A)和分蘗期(B)的植株形態(tài)以及分蘗期葉片表型(C)Fig.1 The phenotype of wild-type (WT)and pyl3 mutant at the seedling (A)and tillering (B)stages and flag leaf at tillering stage (C)

2.2 pyl3突變體的光合色素含量分析

為了確定pyl3突變體的淡黃葉表型是否由光合色素含量變化導致，試驗在苗期對野生型和pyl3突變體的光合色素含量進行了測定。結果顯示，突變體pyl3的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著低于野生型(圖2)。表明突變體pyl3的淡黃葉表型主要是光合色素含量下降所致。

圖2 野生型和pyl3突變體在苗期的光合色素含量比較Fig.2 Comparison of photosynthetic pigment contents between wild-type (WT)and pyl3 mutant at seeding stage

2.3 pyl3的遺傳分析

為了分析pyl3突變體淡黃葉表型的遺傳特性，將其分別與野生型R907和葉色正常的秈稻9311雜交，觀察F1和F2植株的表型。pyl3/R907和pyl3/9311后代群體的觀察與統(tǒng)計分析結果表明，2個雜交組合F1植株葉片顏色均表現(xiàn)為正常，進一步統(tǒng)計F2群體中正常葉色和淡黃葉表型的植株數(shù)，卡方(χ2)測驗結果顯示正常綠葉與淡黃葉植株的分離比例符合3∶1(表3)，表明pyl3突變體的淡黃葉表型是由1對隱性核基因控制。

表3 pyl3突變體基因的遺傳分析Table 3 Genetic analysis on pale yellow leaf phenotype of pyl3 mutant

2.4 pyl3突變基因的定位

為了定位和克隆pyl3基因，本研究利用108對具有多態(tài)性的SSR標記和12對InDel分子標記進行pyl3的基因定位，利用分子標記連鎖分析的方法將pyl3基因定位于水稻第3號染色體長臂上的InDel標記M4和M6之間、物理距離約為3.2 Mb的區(qū)間內(nèi)(圖3-A)。

2.5 候選基因序列分析

為了克隆pyl3基因，在初步定位結果基礎上，進一步利用基于BSA全基因組重測序方法進行聯(lián)合分析(圖3-B)。以日本晴基因組序列作為參考序列，分析結果發(fā)現(xiàn)在初定位的3.2 Mb的區(qū)間內(nèi)有1個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與突變表型完全連鎖(SNP index=1)，該SNP位于編碼鎂離子螯合酶Ⅰ亞基的ChlI/Chl9(LOC_Os03g36540)基因內(nèi)(表4)。分別擴增野生型和pyl3突變體的ChlI/Chl9基因并進行測序分析，DNA測序分析結果顯示，pyl3突變體在ChlI/Chl9基因第3外顯子上編碼區(qū)第1 034位堿基由C突變?yōu)門，導致其編碼氨基酸的第345位的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)槔野彼?Tyr)(圖3-C、D)。進一步對水稻、高粱、甘藍、玉米、陸地棉、可可樹、木薯、二穗短柄草和擬南芥中CHLI蛋白的同源序列進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)該突變氨基酸即第345位處的野生型氨基酸在不同物種中高度保守(圖3-E)。

表4 BSA分析定位區(qū)間的候選基因Table 4 BSA analysis of the candidate gene within the mapped interval

2.6 葉綠素合成與光合作用途徑相關基因的表達

為了研究pyl3突變體中ChlI/Chl9pyl3基因突變對葉綠素合成和光合作用途徑的影響，進一步利用qRT-PCR對這些途徑相關基因的表達量進行分析。結果表明，與野生型相比，在pyl3突變體中編碼原葉綠素酸酯氧化還原酶B基因PORB、葉綠素a加氧酶CAO1、聯(lián)乙烯還原酶基因DVR和葉綠素合酶基因YGL1的表達顯著上調(diào)；編碼谷氨酰-tRNA還原酶HEMA1、NADPH原葉綠素酸酯氧化還原酶A基因PORA、鎂離子螯合酶D亞基、H亞基和Ⅰ亞基基因CHLD、CHLH和CHLI的表達無顯著變化(圖4-A)。在光合作用相關基因中，編碼捕光葉綠素a/b結合蛋白的基因Cab1R，編碼光反應中心蛋白的基因PsaA以及編碼PSII反應中心蛋白的基因PsbA表達量均顯著上調(diào)；分別編碼核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基和小亞基基因的RbcL和RbcS表達量顯著下調(diào)；捕光葉綠素a/b結合蛋白基因Cab2R表達無顯著變化(圖4-B)。

注：A：pyl3基因定位到第3號染色體InDel標記M4和M6之間；B：基于BSA全基因組重測序分析候選基因；C：測序分析候選基因突變位點；D：Os03g36540基因結構，黑色方框代表外顯子，灰色方框代表UTRs，黑色線條代表內(nèi)含子，以及chl9、ell和pyl3三個等位基因的不同突變位點；E：不同物種中CHLI 同源蛋白氨基酸序列比對，其中OsCHLI、SbiCHLI、BolCHLI、ZmaCHLI、GraCHLI、TcaCHLI、MesCHLI、BdiCHLI和AthHLI分別代表水稻 (Oryza sativa L.)、高粱 (Sorghum bicolor)、甘藍 (Brassica oleracea)、玉米(Zea mays L.)、陸地棉 (Gossypium hirsutum Linn.)、可可樹 (Theobroma cacao)、木薯 (Manihot esculenta)、二穗短柄草 (Brachypodium distachyon)和擬南芥 (Arabidopsis thaliana)；紅框代表CHLI/CHL9 pyl3蛋白突變位點處的氨基酸。Note:A:Primary mapping of pyl3 gene,the which was primarily mapped between InDel markers M4 and M6 on the long arm of chromosome 3.B:Mapping pyl3 by BSA based whole genome resequencing analysis.C:Sanger sequencing analysis the mutation site of candidate gene.D:Structure of LOC_Os03g36540. Black boxes indicate exons,gray color boxes indicate UTRs,black lines indicate introns and the corresponding mutation sites of the different three alleles of chl9,ell and pyl3 are marked by black line in the third exon,respectively.E:Amino acid sequence alignment of CHLI homologous proteins in different species by DNAMAN software.OsCHLI,SbiCHLI,BolCHLI,ZmaCHLI,GraCHLI,TcaCHLI,MesCHLI,BdiCHLI,and AthHLI represent Rice (Oryza sativa L.),Sorghum (Sorghum bicolor),Cabbage (Brassica oleracea),Maize (Zea mays L.),Upland cotton (Gossypium hirsutum Linn.),Cacao tree (Theobroma cacao),Cassava (Manihot esculenta),Purple false brome (Brachypodium distachyon)and Arabidopsis (Arabidopsis thalianathe),respectively.Red box indicates the amino acid at the mutation site of CHLI/CHL9 pyl3 in different species.圖3 pyl3基因的定位與候選基因分析Fig.3 Molecular mapping and candidate gene analysis of pyl3 gene

3 討論

葉片是植物光合作用的主要場所，葉色通常直接或間接受光合色素合成途徑相關基因的調(diào)控。葉綠素在植物收集光能進行光合作用和轉換能量過程具有至關重要的作用。高等植物的葉綠素生物合成是一系列復雜的過程[9,30]。該代謝途徑中相關基因發(fā)生突變可能影響葉綠素的合成，從而引起不同程度的葉色變異，嚴重時可能導致植株死亡[18,31]。前人研究表明在葉綠素合成過程中葉綠素酸酯a是葉綠素a和葉綠素b的前體，葉綠素酸酯a分別在葉綠素合酶和葉綠素酸酯a氧化酶的催化下合成葉綠素a和葉綠素酸酯b，葉綠素合酶催化葉綠素酸酯b生成葉綠素b[9]。本研究中，突變體pyl3葉片中葉綠素含量顯著降低(圖2)，說明葉綠素合成過程中相關酶的功能可能受到影響，導致突變體葉綠素合成途徑受阻、光合作用出現(xiàn)異常，使突變體出現(xiàn)淡黃葉表型，導致農(nóng)藝性狀發(fā)生改變(表2)。

通過分子標記連鎖分析和基于BSA全基因組重測序的定位方法，確定了pyl3突變體是由于葉綠素合成酶基因CHLI的突變所致。研究表明CHLI編碼415個氨基酸的Mg螯合酶亞基Ⅰ，該蛋白的C-末端從第93到第415位氨基酸有一個保守的AAA+的Mg螯合酶結構域[32]。水稻中已報道的CHLI基因突變體有chl9和ell；其中，chl9在CHLI編碼區(qū)919位由C變成T，造成307位的精氨酸變成半胱氨酸，導致葉綠素合酶活性降低，影響了葉綠體的發(fā)育和光合作用，最終導致葉綠素含量下降而表現(xiàn)出全生育期的黃化[12]。ell突變發(fā)生在CHLI編碼區(qū)的529位，導致其保守區(qū)域編碼的第177位氨基酸由G突變?yōu)镽，阻礙了CHLI和CHLD亞基的互作，導致水稻葉片葉綠素合成受阻以及三葉期后致死[18]。本研究中不同物種鎂離子螯合酶Ⅰ亞基的氨基酸序列分析表明，pyl3突變體攜帶的CHLI/CHL9pyl3蛋白的第345位突變位點位于AAA+ Mg螯合酶結構域內(nèi)，并且該突變位點處對應的野生型半胱氨酸在水稻和擬南芥等高等植物中高度保守(圖3-D)，說明該位點的半胱氨酸可能對該蛋白的正常功能具有至關重要的作用。雖然chl9、ell與pyl3三個突變體的突變位點都發(fā)生在保守的AAA+的結構域內(nèi)，但ell的突變在該結構域靠前的位置，導致ell突變體在三葉期致死，可能功能缺失更為嚴重；而pyl3和chl9的突變在AAA+的結構域靠后的位置，雖然這兩個突變體與ell具有相似的表型，但不是致死突變。因此，相對于ell突變體，pyl3和chl9是CHLI基因的弱等位變異，可能是在CHLI基因不同位置發(fā)生突變導致編碼的蛋白具有不同功能所致。

基因表達分析結果表明，PLY3/CHLI基因在pyl3突變體中的表達與野生型相比變化不顯著(圖4-A)，同時該突變位點是AAA+結構域中的保守位點(圖3-E)，表明PLY3/CHLI基因突變對功能的影響可能是通過改變氨基酸序列從而影響蛋白的功能，而不是通過改變轉錄水平影響。因此，CHLI的突變導致其功能的變化，使得葉綠素合成途徑受到抑制，降低核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基和小亞基基因的RbcL和RbcS基因的表達(圖4-B)。此外，在pyl3突變體中可能還存在反饋調(diào)控機制，當CHLI/CHL9pyl3突變影響其編碼蛋白功能后，反饋調(diào)控機制可能反向上調(diào)了其他葉綠素合成相關基因PORB、CAO1、DVR和YGL1以及光合作用相關基因Cab1R、PsaA和PsbA的表達(圖4)，以彌補CHLI/CHL9pyl3基因突變的影響。但是，反饋調(diào)控機制可能無法完全彌補CHLI/CHL9pyl3基因突變對葉綠素合成和光合作用途徑的影響，從而影響葉綠體的發(fā)育，造成葉綠素含量降低，最終導致pyl3突變體呈現(xiàn)淡黃葉表型。

4 結論

本研究通過輻射誘變獲得了一份淡黃葉突變體pyl3。與野生型相比，pyl3突變體在水稻生長的全生育期均表現(xiàn)出淡黃葉表型，葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低。相比野生型，pyl3突變體株高降低，結實率、穗長和穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀指標下降。遺傳分析結果表明，pyl3的突變表型受一對隱性核基因控制。利用分子標記連鎖分析與基于BSA全基因組重測序的聯(lián)合基因定位結果表明，pyl3的突變表型是由編碼Mg-原卟啉Ⅸ螯合酶CHLI亞基的基因編碼區(qū)第1 034堿基突變所致，導致編碼的第345位的氨基酸發(fā)生變化，從而引起葉片中葉綠素合成和光合作用相關基因的表達發(fā)生變化。pyl3突變體攜帶的CHLI/CHL9pyl3基因是已報道的水稻chl9/chli淺黃綠葉基因的新等位基因，而pyl3也是CHLI/CHL9基因的新等位突變體；二者的發(fā)現(xiàn)為進一步研究CHLI/CHL9基因的功能和水稻葉色形成調(diào)控的分子機制提供了新的研究材料與基因資源。