鄭晟超，毛佳斌，何大強(qiáng)

1.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 結(jié)核科，浙江 杭州 310015；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310006

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。盡管近幾十年來肺癌診斷和治療方面取得了顯著進(jìn)展，但5年生存率仍然低于20%[2]。山奈素是一種天然存在于茶以及許多常見的蔬菜和水果中的類黃酮化合物[3]。研究表明，山奈素在乳腺癌中顯示出抗增殖和促凋亡的功效[4]，還可以增強(qiáng)人肺癌A549細(xì)胞的化學(xué)敏感性[5]。但山奈素在肺癌細(xì)胞生物行為中的功能和機(jī)制仍未闡明。環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）被報(bào)道在肺癌的癌變和發(fā)展過程中異常表達(dá)，并作為重要的調(diào)控元件，為肺癌的診斷和預(yù)后提供潛在的靶點(diǎn)[6]。先前的研究表明，circ-RPL15作為一種新型致癌驅(qū)動(dòng)因子，促進(jìn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病的進(jìn)展[7]，但circ-RPL15在肺癌進(jìn)展中的潛在功能尚不清楚。本研究探討山奈素在肺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡過程中的功能，并結(jié)合circ-RPL15進(jìn)一步闡明其可能的作用方式。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：肺癌細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑：山奈素（純度≥98%）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）購自日本Dojindo公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（propidium iodide, PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；裂解-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase3）抗體購自美國Abcam公司；PrimeScript RT試劑盒購自大連TaKaRa公司；SYBR Green Master Mix購自美國Applied Biosystems公司。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：肺癌細(xì)胞在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并保存在37 ℃、5% CO2、飽和濕潤恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理：山奈素以培養(yǎng)基稀釋成25、50、75 μg/mL，給藥時(shí)分別將25、50、75 μg/mL山奈素[4]作用于對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞48 h，對應(yīng)山奈素25 μg/mL組、山奈素50 μg/mL組、山奈素75 μg/mL組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞設(shè)為對照組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將1×105細(xì)胞/孔的肺癌細(xì)胞接種到6孔板中，至細(xì)胞覆蓋60%～70%的培養(yǎng)板時(shí)，通過Lipofectamine 2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。靶向circ-RPL15的siRNA（si-circ-RPL15）用于沉默circ-RPL15，siRNA NC（si-NC）作為其陰性對照，過表達(dá)circ-RPL15的pcDNA-circ-RPL15用于過表達(dá)circ-RPL15，這些質(zhì)粒均由上海GenePharma公司提供。實(shí)驗(yàn)分為si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-circ-RPL15組（轉(zhuǎn)染si-circ-RPL15）、對照組（正常培養(yǎng)）、山奈素組（75 μg/mL山奈素）和山奈素+pcDNA-circ-RPL15組（轉(zhuǎn)染pcDNA-circ-RPL15和75 μg/mL山奈素）。用si-circ-RPL15、si-NC、pcDNA-circ-RPL15轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞6～8 h，將轉(zhuǎn)染物替換為完全培養(yǎng)基或含75 μg/mL山奈素的完全培養(yǎng)基，保持48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中，轉(zhuǎn)染效率通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞活力：將肺癌細(xì)胞以2×103個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中。72 h后，將10 μL CCK-8溶液滴入每個(gè)孔中，然后在37 ℃下孵育2 h。在450 nm處Spectramax M5微孔板檢測儀器測量吸光度OD值。

1.2.4 平板克隆檢測細(xì)胞克隆形成：將肺癌細(xì)胞以300個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板中，以含有10% FBS的完全培養(yǎng)基生長。溫育2周后，對細(xì)胞進(jìn)行甲醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色。使用顯微鏡人工計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集2×105個(gè)肺癌細(xì)胞，用Annexin V-FITC和PI在黑暗中染色20 min。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測Cleavedcaspase3蛋白的表達(dá)：使用RIPA緩沖液從肺癌細(xì)胞中提取總蛋白。對樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后，將膜在室溫下含5%脫脂牛奶的Tris緩沖液中孵育2 h，然后與Cleaved-caspase3和GAPDH一抗孵育18 h。與二抗孵育2 h。ECL試劑盒觀察免疫印跡，并使用ImageJ軟件掃描分析，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算Cleaved-caspase3相對表達(dá)量。

1.2.7 Transwell法檢測細(xì)胞遷移：使用具有8 μm孔徑的24孔Transwell室進(jìn)行細(xì)胞遷移測定。肺癌細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/mL重新懸浮在100 μL無血清培養(yǎng)基中。將其接種在上腔室中，并向下室中加入600 μL 10% FBS培養(yǎng)基。經(jīng)過48 h孵育后，使用棉簽擦拭上膜表面的細(xì)胞。將遷移到下膜的細(xì)胞進(jìn)行甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8 RT-qPCR檢測circ-RPL15、miR-489-3p表達(dá)：使用TRIzol試劑從肺癌細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的cDNA。使用SYBR Green Master Mix對cDNA進(jìn)行RT-qPCR。引物序列如下：circ-RPL15 F：5’-CCTTCAGTAAGCC AAGAT-3’，R：5’-GCTCGAAGCCTTCAGTAAG-3’。miR-489-3p F：5’-GCGGCAGGGGGAAAGTTCTA-3’，R：5’-GTGCAG GGTCCGAGGTATTC-3’。GAPDH F：5’-TCCTCCACCTTTGA TGCG-3’，R：5’-GTGCCTGGCTCACTCCTT-3’。U6 F：5’-T GGAGTTGATCCTAGTCTGG-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGG TATTC-3’。GAPDH用作circ-RPL15的內(nèi)參，而U6用作miR-489-3p的內(nèi)參。通過2-ΔΔCt方法確定circ-RPL15、miR-489-3p相對表達(dá)。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：生物信息學(xué)預(yù)測由Starbase軟件執(zhí)行。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證circ-RPL15和miR-489-3p之間的組合。將circ-RPL15野生型（WT）和突變型（MUT）序列插入pmirGLO載體，形成WT-circ-RPL15、MUT-circ-RPL15熒光素酶載體。然后在肺癌細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ-RPL15或MUT-circ-RPL15與miR-NC或miR-489-3p模擬物（序列參照文獻(xiàn)[8]），使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測48 h后的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山奈素對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 不同質(zhì)量濃度山奈素作用于肺癌細(xì)胞后，山奈素25 μg/mL組、山奈素50 μg/mL組、山奈素75 μg/mL組的細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)均較對照組降低，凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)量均較對照組升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（見圖1）。

圖1 山奈素對A549增殖和凋亡的影響

2.2 山奈素對肺癌細(xì)胞遷移的影響 山奈素25 μg/mL組、山奈素50 μg/mL組、山奈素75 μg/mL組肺癌細(xì)胞的遷移數(shù)均低于對照組（P＜0.05），且呈濃度依賴性（見圖2）。

圖2 山奈素對A549遷移的影響（×200）

2.3 山奈素對肺癌細(xì)胞中circ-RPL15、miR-489-3p mRNA表達(dá)的影響 山奈素25 μg/mL組、山奈素50 μg/mL組、山奈素75 μg/mL組肺癌細(xì)胞中circ-RPL15 mRNA表達(dá)量均比對照組低，而miR-489-3p mRNA表達(dá)量均比對照組高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（見圖3）。

圖3 山奈素對A549中circ-RPL15、miR-489-3p mRNA表達(dá)的影響

2.4 沉默circ-RPL15對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響 在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-circ-RPL15沉默circ-RPL15，si-circ-RPL15組circ-RPL15 mRNA表達(dá)量較si-NC組減少，提示轉(zhuǎn)染有效。si-circ-RPL15組miR-489-3p mRNA表達(dá)量較si-NC組增加，且sicirc-RPL15組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)較si-NC組降低，凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)量較si-NC組升高，si-circ-RPL15組遷移細(xì)胞數(shù)也較si-NC組減少（P＜0.05），見圖4。

圖4 沉默circ-RPL15對A549增殖、凋亡、遷移的影響

2.5 circ-RPL15靶向調(diào)控miR-489-3p 軟件Starbase對circ-RPL15和miR-489-3p的互補(bǔ)序列進(jìn)行預(yù)測。miR-489-3p模擬物與WT-circ-RPL15共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性約比miR-NC與WT-circ-RPL15共轉(zhuǎn)染減少77.55%（P＜0.05），而miR-489-3p或miR-NC與MUTcirc-RPL15共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 circ-RPL15和miR-489-3p的互補(bǔ)序列及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6 過表達(dá)circ-RPL15對山奈素作用的肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響 山奈素組肺癌細(xì)胞中circ-RPL15表達(dá)量低于對照組，miR-489-3p表達(dá)量高于對照組，細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)低于對照組，凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)量高于對照組，且遷移細(xì)胞數(shù)低于對照組（P＜0.05）。在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-circ-RPL15過表達(dá)circ-RPL15后，山奈素+pcDNA-circ-RPL15組circ-RPL15表達(dá)量比山奈素組高，miR-489-3p表達(dá)量比山奈素組低，細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)比山奈素組高，凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)量比山奈素組低，并且遷移細(xì)胞數(shù)比山奈素組高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 過表達(dá)circ-RPL15可逆轉(zhuǎn)山奈素對A549增殖、凋亡、遷移的作用

3 討論

山奈素是一種天然存在的類黃酮，對肝損傷、肥胖癥和糖尿病具有有益作用[3]。此外，在一些人類腫瘤細(xì)胞系中，山奈素具有強(qiáng)大的抗癌活性。例如，山奈素衍生物對三種人類癌細(xì)胞系Hela、HCC1954、SK-OV-3表現(xiàn)出抗增殖活性[9]。在肺癌中，山奈素被報(bào)道能減少低氧應(yīng)激，并增強(qiáng)阿霉素在A549細(xì)胞球體中的積累和敏感性，山奈素可能有助于預(yù)防肺癌的發(fā)展[5]。山奈素還可以劑量-時(shí)間依賴方式減緩胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖并加速凋亡[10]。與前述研究類似，本研究發(fā)現(xiàn)，25、50、75 μg/mL山奈素對肺癌細(xì)胞的增殖和遷移具有顯著抑制效果，并對細(xì)胞凋亡和凋亡執(zhí)行蛋白Cleavedcaspase3表達(dá)具有促進(jìn)作用，且呈一定的濃度依賴性，表明山奈素可能是治療肺癌的潛在有效藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度山奈素作用于肺癌細(xì)胞A549后，circ-RPL15表達(dá)被抑制，且這種抑制作用呈濃度依賴性，提示山奈素發(fā)揮抗肺癌惡性生物行為的作用可能與下調(diào)circ-RPL15有關(guān)。研究表明，circ-RPL15在慢性淋巴細(xì)胞白血病病例的血漿外泌體中高表達(dá)，參與慢性淋巴細(xì)胞白血病病理進(jìn)展[7]。circ-RPL15在胃癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，這種上調(diào)明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡[11]。Circ-RPL15在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，通過競爭性結(jié)合miR-146b-3p觸發(fā)膠質(zhì)瘤的增殖和遷移潛能[12]。盡管如此，目前未見關(guān)于肺癌中circ-RPL15的研究報(bào)道。本研究與前述報(bào)道[11]吻合，沉默circ-RPL15則能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并加速細(xì)胞凋亡，表明circ-RPL15在肺癌中充當(dāng)促癌因子。另外，過表達(dá)circ-RPL15逆轉(zhuǎn)了山奈素作用的肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移情況，表明山奈素的抗肺癌功能與下調(diào)circ-RPL15有關(guān)。

研究表明，miR-489-3p在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，miR-489-3p的上調(diào)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡并抑制其增殖[13]。miR-489-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[14]、膀胱癌[8]中下調(diào)，miR-489-3p模擬物使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移降低，并促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡?？梢姡琺iR-489-3p是肺癌等腫瘤的抑制劑。越來越多的證據(jù)表明，circRNA可以作為競爭性內(nèi)源性RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）或miRNA海綿來抑制miRNA的功能[15-16]。例如circDHX33通過靶向調(diào)控miR-489-3p促進(jìn)腎細(xì)胞癌的惡性行為[17]。本研究確定了circ-RPL15和miR-489-3p的靶向結(jié)合關(guān)系，且下調(diào)circ-RPL15可以促進(jìn)miR-489-3p的表達(dá)，circ-RPL15可能作為miR-489-3p ceRNA發(fā)揮致癌作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度山奈素作用于肺癌細(xì)胞A549后，miR-489-3p的表達(dá)上調(diào)，且過表達(dá)circ-RPL15可以逆轉(zhuǎn)山奈素對miR-489-3p表達(dá)的促進(jìn)作用。綜合這些結(jié)果來看，山奈素通過下調(diào)circ-RPL15靶向調(diào)控miR-489-3p，從而在肺癌細(xì)胞中起抗增殖、抗遷移和促凋亡的作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)山奈素可以通過下調(diào)circ-RPL15靶向調(diào)控miR-489-3p的表達(dá)，對肺癌細(xì)胞增殖和遷移起抑制作用，并促進(jìn)其凋亡，山奈素可能成為肺癌的理想治療藥物。