伊紀(jì)亮，鄭娟，張萍

喉鱗狀細(xì)胞癌，簡(jiǎn)稱喉鱗癌，是發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)的耳鼻喉科常見(jiàn)惡性腫瘤［1］，其治療主要有手術(shù)、化療和放療，但療效一直不佳［2］。因此，需要尋找新的治療喉鱗癌的新方法。KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1（KCNQ1OT1）是一種在乳腺癌和舌癌中表達(dá)上調(diào)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），其分別通過(guò)靶向miR-145∕細(xì)胞周期蛋白E2（CCNE2）、miR-211-5p∕Ezrin軸促進(jìn)乳腺癌和舌癌的發(fā)展進(jìn)程［3-4］。此外，對(duì)奧沙利鉑耐藥的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)升高，敲減KCNQ1OT1可通過(guò)靶向miR-7-5p∕ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體亞家族C成員1（ABCC1）軸降低肝細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性，KCNQ1OT1可作為改善肝細(xì)胞癌奧沙利鉑耐藥的分子靶點(diǎn)［5］。然而，KCNQ1OT1對(duì)喉鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，KCNQ1OT1可能調(diào)控miR-506-3p的表達(dá)。miR-506是喉鱗癌細(xì)胞系中表達(dá)降低的微小RNA（miRNA），過(guò)表達(dá)miR-506可增強(qiáng)喉鱗癌細(xì)胞的放射敏感性［6］。本研究于2019年5月至2020年2月，首先采用RT-qPCR法檢測(cè)了45例喉鱗癌患者的癌組織及癌旁組織中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達(dá)；同時(shí)以人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38為對(duì)照，采用RT-qPCR法檢測(cè)了喉鱗癌細(xì)胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達(dá)；最后，以喉鱗癌細(xì)胞系HCC345為研究對(duì)象，主要探討了KCNQ1OT1能否靶向miR-506-3p調(diào)控HCC345細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料喉鱗癌組織及癌旁組織采集自2016年5月至2018年1月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院桓臺(tái)分院確診并行手術(shù)治療的45例原發(fā)喉鱗癌病人，液氮保存。男29例，女16例，年齡（56.39±8.47）歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》原則，病人自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38，上海研生實(shí)業(yè)有限公司；喉鱗癌細(xì)胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；LipofectamineTM2000試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）∕碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶；PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒，大連寶生物；引物序列、KCNQ1OT1小干擾RNA（si-KCNQ1OT1）及陰性序列（si-NC）、miR-506-3p模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-506-3p）、模擬對(duì)照序列（miR-NC）及抑制劑陰性序列（anti-miR-NC），廣州銳博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)WI-38、EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345細(xì)胞均用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種對(duì)數(shù)期各細(xì)胞至6孔板（1.0×105個(gè)∕孔），培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達(dá)。

1.3.2RT-qPCR實(shí)驗(yàn)在獲得的樣本組織及細(xì)胞中加Trizol試劑，提取總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列：KCNQ1OT1正向5'-TGG TAA GTT ACA GGG CAG GG-3'，反向5'-TGA ACA TCC ATC CCC AAG CT-3'；GAPDH正 向5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT GG-3'，反向5'-GTA GTT GAG GTC AAT GAA GGG-3'；miR-506-3p正向5'-ACC ACC ATC AGC CAT ACT ATG T-3'，反向5'-TGT TGC ACA TTA CTC TAC TCA GA-3'；U6正向5'-CGT CGA CGT GCA TGC ACG-3'，反向5'-GCT TAA GCT AGC TAG CGC-3'。用2-ΔΔCt法計(jì)算KCNQ1OT1相對(duì)GAPDH、miR-506-3p相對(duì)U6的表達(dá)。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種對(duì)數(shù)期HCC345細(xì)胞至6孔板（1.0×105個(gè)∕孔），培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1（si-KCNQ1OT1組）、（si-NC組）、或共轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1與anti-miR-506-3p（si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-3p組）、si-KCNQ1OT1與anti-miR-NC（si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組）至HCC345細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)細(xì)胞中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后，將細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4MTT實(shí)驗(yàn)于96孔板中將轉(zhuǎn)染后的四組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞起始數(shù)量均為2.5×104個(gè)∕孔。培養(yǎng)后，加20 μL MTT（5 g∕L）將細(xì)胞孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加150 μL二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度（A）值。

1.3.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡于24孔板中將轉(zhuǎn)染后的四組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞起始數(shù)量均為5.0×104個(gè)∕孔。培養(yǎng)后，收集各組細(xì)胞，利用Annexin V-FITC∕PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.6Transwell實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)：于Transwell上室接種各組細(xì)胞，起始數(shù)量均為5.0×104個(gè)∕孔。下室加500 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，取出上室，將下室細(xì)胞進(jìn)行固定和染色處理后，于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：除預(yù)先在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠外，操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.7KCNQ1OT1與miR-506-3p靶向關(guān)系驗(yàn)證由上海生工構(gòu)建含miR-506-3p結(jié)合位點(diǎn)的KCNQ1OT1野生型熒光素酶報(bào)告載體（KCNQ1OT1-WT），同時(shí)突變結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建KCNQ1OT1突變型熒光素酶報(bào)告載體（KCNQ1OT1-MUT）。接種對(duì)數(shù)期HCC345細(xì)胞至6孔板（1.0×105個(gè)∕孔），培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics（或miR-NC）與KCNQ1OT1-WT（或KCNQ1OT1-MUT）至HCC345細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞并裂解。用半徑10 cm離心機(jī)行離心（3 500 r∕min、10 min）處理后，取20 μL上清液，加100 μL 1×螢火蟲(chóng)或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液，檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞熒光素酶活性以螢火蟲(chóng)與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。組織和細(xì)胞系中KCNQ1OT1和miR-506-3p的表達(dá)、各組細(xì)胞活力、凋亡率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)及熒光素酶活性均符合正態(tài)分布，用±s表示。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)兩組間各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 KCNQ1OT1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)情況喉鱗狀細(xì)胞癌組織中KCNQ1OT1表達(dá)量 為0.81±0.09，較 癌 旁 組 織0.27±0.08升 高（t=30.08，P＜0.05）；喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-506-3p表達(dá)量為0.24±0.08，較癌旁組織0.83±0.09降低（t=14.70，P＜0.05）。喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345中KCNQ1OT1表達(dá)量分別為2.44±0.22、2.69±0.21、3.61±0.24、較WI-38細(xì)胞1.00±0.13均升高（P＜0.05）；miR-506-3p表達(dá)分別為0.41±0.13、0.30±0.12、0.22±0.11，較WI-38細(xì)胞1.00±0.12均降低（P＜0.05）。選擇KCNQ1OT1和miR-506-3p表達(dá)較WI-38細(xì)胞差異最顯著的喉鱗癌細(xì)胞系HCC345進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞增殖和凋亡的影響KCNQ1OT1在si-NC組 和si-KCNQ1OT1組HCC345細(xì)胞中的表達(dá)量分別為0.61±0.16、0.14±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.41，P＜0.05），說(shuō)明si-KCNQ1OT1組HCC345細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)較si-NC組被敲減。si-KCNQ1OT1組HCC345細(xì)胞活力為0.41±0.06，較si-NC組細(xì)胞活力0.81±0.12降低（t=8.94，P＜0.05）。si-KCNQ1OT1組HCC345細(xì)胞凋亡率為（34.13±3.60）%，較si-NC組細(xì)胞凋亡率（3.79±2.37）%升高（t=21.12，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞凋亡的影響

2.3 敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞遷移和侵襲的影響si-KCNQ1OT1組HCC345細(xì)胞遷移數(shù)低于si-NC組［（86.32±15.21）個(gè)比（162.31±20.23）個(gè)，t=9.01，P＜0.05］，侵襲數(shù)低于si-NC組［（65.23±12.05）個(gè)比（140.26±18.27）個(gè)，t=10.29，P＜0.05］。見(jiàn)圖2。

圖2 敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.4 KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-506-3p表達(dá)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示的KCNQ1OT1與miR-506-3p的核苷酸序列的連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。共轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics與KCNQ1OT1-WT的HCC345細(xì)胞熒光素酶活性為0.36±0.14，較共轉(zhuǎn)染miR-NC與KCNQ1OT1-WT的HCC345細(xì)胞熒光素酶活性1.00±0.13降 低（t=10.05，P＜0.05）；共 轉(zhuǎn) 染miR-506-3p mimics與KCNQ1OT1-MUT、miR-NC與KCNQ1OT1-MUT的HCC345細(xì)胞熒光素酶活性為1.02±0.12、1.03±0.17，兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.16，P=0.87）。同時(shí)miR-506-3p在si-KCNQ1OT1組HCC345細(xì)胞中的表達(dá)量為3.34±0.21，顯著高于si-NC組1.00±0.16（t=26.59，P＜0.05）。

圖3 KCNQ1OT1與miR-506-3p的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 敲減miR-506-3p逆轉(zhuǎn)了敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞增殖和凋亡的影響miR-506-5p在KCNQ1OT1+anti-miR-NC組和si-KCNQ1OT1+antimiR-506-5p組HCC345細(xì)胞中的表達(dá)量分別為1.00±0.09、0.25±0.06，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.80，P＜0.05），說(shuō)明si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組HCC345細(xì)胞中miR-506-5p表達(dá)較KCNQ1OT1+anti-miR-NC組被敲減。si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組HCC345細(xì)胞活力為0.82±0.11，較si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組細(xì)胞活力0.43±0.05升高（t=9.68，P＜0.05）；si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組 細(xì) 胞 凋 亡 率 為（5.32±1.85）%，較si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組細(xì)胞凋亡率（30.25±3.48）%降低（t=18.98，P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 敲減miR-506-3p和敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞凋亡的影響

2.6 敲減miR-506-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞遷移和侵襲的影響si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組細(xì)胞遷移數(shù)高于si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組［（158.26±19.24）個(gè) 比（88.31±15.39）個(gè)，t=8.52，P＜0.05］，侵襲數(shù)高于si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組［（138.25±19.05）個(gè) 比（66.27±12.39）個(gè)，t=9.50，P＜0.05］。見(jiàn)圖5。

圖5 敲減miR-506-3p和敲減KCNQ1OT1對(duì)HCC345細(xì)胞遷移和侵襲的影響

3 討論

lncRNA在真核生物中廣泛存在，其可發(fā)揮miRNA分子海綿作用的表達(dá)調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，共同影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。例如，LncRNA CASC2是肝癌組織中表達(dá)降低的lncRNA，過(guò)表達(dá)lncRNA CASC2可競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-24-3p阻礙肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。既往研究顯示，喉鱗癌也存在大量異常表達(dá)的lncRNA，如lncRNA CCAT2［8］、lncRNA FGD5-AS1［9］、LncRNA FEZF1-AS1［10］等lncRNA在喉鱗癌中表達(dá)升高，促進(jìn)喉鱗癌的發(fā)展進(jìn)程；lncRNA GAS5是喉鱗癌中表達(dá)下調(diào)的lncRNA，過(guò)表達(dá)lncRNA GAS5通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-26a-5p∕UNC-51樣激酶2（ULK2）軸抑制喉鱗癌細(xì)胞的惡性行為［11］。

KCNQ1OT1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在多種惡性腫瘤中起調(diào)控作用。報(bào)道稱，KCNQ1OT1在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，參與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展［12］；敲減KCNQ1OT1可降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，KCNQ1OT1是卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn)［13］；KCNQ1OT1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-296-5p∕缺氧上調(diào)蛋白（HYOU1）軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［14］；KCNQ1OT1在順鉑的結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)KCNQ1OT1通過(guò)靶向miR-497進(jìn)而抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的表達(dá)降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，KCNQ1OT1是改善結(jié)直腸癌順鉑耐藥的潛在分子靶點(diǎn)［15］。本研究結(jié)果顯示，KCNQ1OT1在喉鱗癌組織及細(xì)胞系中均表達(dá)增加，敲減KCNQ1OT1造成了喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲受到抑制，而凋亡加劇，這提示敲減KCNQ1OT1有利于延緩喉鱗癌的發(fā)展進(jìn)程，KCNQ1OT1也可能成為喉鱗癌治療的新靶點(diǎn)。

此外，本研究首先證實(shí)了KCNQ1OT1結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-506-3p。miR-506-3p是前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低的miRNA，上調(diào)miR-506-3p對(duì)前列腺癌細(xì)胞的惡性行為起抑制作用［16］；miR-506-3p在骨肉瘤中也發(fā)揮抑癌基因作用，其通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)削弱骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移行性，阻礙骨肉瘤的發(fā)展進(jìn)程［17］；miR-506-3p通過(guò)靶向抑制zeste 2多梳抑制復(fù)合物2亞基增強(qiáng)子（EZH2）的表達(dá)阻礙結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程［18］；miR-506-3p表達(dá)的上調(diào)可阻礙肝癌細(xì)胞增殖［19］。本研究顯示，喉鱗癌組織及細(xì)胞系中miR-506-3p的表達(dá)明顯降低，與Tang等［6］報(bào)道結(jié)果一致；同時(shí)，本研究恢復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，敲減miR-506-3p逆轉(zhuǎn)了敲減KCNQ1OT1表達(dá)對(duì)HCC345細(xì)胞惡性行為的影響，這提示KCNQ1OT1通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-506-3p來(lái)影響喉鱗癌細(xì)胞的惡性行為。

綜上所述，KCNQ1OT1在喉鱗癌組織及細(xì)胞系中KCNQ1OT1呈高表達(dá)，敲減KCNQ1OT1導(dǎo)致喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲受到抑制，而凋亡加劇，這可能與敲減KCNQ1OT1引起細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)上調(diào)有關(guān)，KCNQ1OT1∕miR-506-3p軸可能為喉鱗狀細(xì)胞癌的治療提供了新靶點(diǎn)，但KCNQ1OT1作用的miR-506-3p的靶基因還有待進(jìn)一步探究。