李鑫，孫茂蒼，崔山龍

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是老年人癡呆癥的最常見原因，是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，逐漸奪走病人的認(rèn)知功能并最終導(dǎo)致死亡［1］。AD每年的新發(fā)病量逐年上升。AD神經(jīng)病理學(xué)的特征在于β樣淀粉蛋白（Aβ）的細(xì)胞外積累。隨著疾病的進(jìn)展，肉眼可見的萎縮影響新皮質(zhì)的內(nèi)嗅區(qū)和海馬區(qū)，杏仁核和關(guān)聯(lián)區(qū)域藍(lán)斑的位置被淡化［2］。Aβ的沉積首先由漫射沉積物制成，淀粉樣蛋白聚焦沉積物構(gòu)成老年斑的核心［3］。在新皮質(zhì)、海馬、紋狀體、中腦以及最后的小腦以及腦橋核（Thal相）中連續(xù)發(fā)現(xiàn)Aβ沉積物［4］。家族性病例表明Aβ沉積是最初的癥狀［5］。miRNA是短鏈內(nèi)源性RNA，其表達(dá)異常可影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)而參與人類多種疾病進(jìn)展，其中包括AD［6-8］。微小RNA-195（miR-195）雖已有報道在AD中的研究，遺憾的是，其發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制與ATP酶陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)13A2（ATP13A2）的關(guān)系尚未有人報道。ATP13A2是遺傳性青少年AD的致病基因［9］，其在AD中的功能尚未有人研究。本研究在2018年3—11月開展實驗，擬以Aβ1-42誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞（PC12細(xì)胞）損傷模型為研究對象，探討過表達(dá)miR-195、沉默ATP13A2、過表達(dá)ATP13A2對Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞炎性因子分泌以及細(xì)胞增殖和凋亡的影響，揭示miR-195和ATP13A2的靶向關(guān)系，以期為AD治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料PC12細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心；Aβ1-42購自日本和光；杜爾伯格氏伊戈爾（DMEM）培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青；噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自科聯(lián)生物；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；雙熒光素酶基因檢測試劑盒、ECL發(fā)光液均購自碧云天生物技術(shù)公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIORAD公司；PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組將正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞標(biāo)記為對照（Control）組。按照吳明等［10］的方法用25 μmol∕mL的Aβ1-42處理PC12細(xì)胞48 h，標(biāo)記為Aβ組。將PC12細(xì)胞分為Aβ1-42+miR-con組、Aβ1-42+miR-195組、Aβ1-42+si-con組、Aβ1-42+ATP13A2小干擾RNA（si-ATP13A2）組、miR-con組、miR-195組、miR-195+pcDNA組、miR-195+ATP13A2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-ATP13A2）組，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒將寡核苷酸或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，部分組用25 μmol∕mL的Aβ1-42處理，用實時定量PCR（qRT-PCR）法檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行下一步實驗。

1.2.3qRT-PCR實驗檢測細(xì)胞中miR-195、ATP13A2的mRNA的表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并用DNaseⅠ消化以除去可能污染的DNA。逆轉(zhuǎn)錄合成模板鏈cDNA，隨后制備20 μL擴(kuò)增體系進(jìn)行qRT-PCR，重復(fù)3次，取平均值，分析Ct值，以2-ΔΔCt法計算miR-195、ATP13A2的相對表達(dá)水平。引物信息：miR-195（正向引物ACGATGCCCACGACCAAGCC；反向引物TAGCAGCACAGAAATATTGGC）；ATP13A2（正向引物5′-ATGGTGACAGGGGACAACCT-3′；反向引物5′-ACTTGAAGACGCTGAATGAAG-3′）。

1.2.4Western blotting檢測細(xì)胞中ATP13A2的蛋白表達(dá)RIPA法提取蛋白后，以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5 min。取60 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移PVDF膜后，加入2.5%脫脂奶粉來阻斷非特異性結(jié)合。將PVDF膜放入1∶1 000稀釋一抗中4℃反應(yīng)過夜，再將PVDF膜轉(zhuǎn)入1∶2 000稀釋的二抗中37℃反應(yīng)2 h。于暗室內(nèi)滴加化學(xué)發(fā)光劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以Qμantity One 4.62軟件測定的目的條帶和β-actin條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)。

1.2.5ELISA實驗檢測細(xì)胞中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量人IL-1β、TNF-α檢測試劑盒用來檢測細(xì)胞中IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.6MTT實驗檢測細(xì)胞的增殖將1.2.2各組細(xì)胞制成調(diào)整至104個∕毫升單細(xì)胞懸液，然后接種至96孔板，每孔加MTT溶液（5 mg∕mL）20 μL，孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩融解結(jié)晶，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度（A）以表示細(xì)胞增殖活性。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡用500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮1.2.2各組細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-∕FITC、5 μL碘化丙啶避光反應(yīng)20 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞凋亡率（%）以早期凋亡率和晚期凋亡率之和表示。

1.2.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細(xì)胞中miR-195與ATP13A2的 表 達(dá)野 生 型∕突 變 型ATP13A2載體由上海吉瑪公司提供。將野生型∕突變型ATP13A2載體分別與miR-195、miR-con共轉(zhuǎn)染，24 h后檢測熒光強(qiáng)度。海參熒光素酶熒光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶熒光強(qiáng)度的比值即反應(yīng)miR-195與ATP13A2的結(jié)合力。

1.2.9統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以±s表示，每組數(shù)據(jù)代表3個平行實驗復(fù)孔，每個實驗重復(fù)3次。采用PEMS 3.2進(jìn)行分析，用Shapiro-Wilk檢驗分析數(shù)據(jù)正態(tài)性，用Levene檢驗分析方差齊性。完全隨機(jī)設(shè)計的兩組均數(shù)的比較采用成組設(shè)計t檢驗；多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞影響miR-195和ATP13A2的表達(dá)與Control組相比，Aβ1-42組PC12細(xì)胞中miR-195的表達(dá)顯著降低（P＜0.001），ATP13A2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.001），見表1，圖1。

表1 miR-195和ATP13A2在Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的表達(dá)∕±s

表1 miR-195和ATP13A2在Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的表達(dá)∕±s

注：miR-195為微小RNA-195，ATP13A2為ATP酶陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)13A2，Aβ為β樣淀粉蛋白。

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圖1 ATP13A2在Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-195抑制寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子的分泌與Control組相比，Aβ1-42組PC12細(xì)胞中miR-195表達(dá)顯著降低（t=15.79，P＜0.001），IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著升高（t=15.12，P＜0.001；t=21.77，P＜0.001）；與Aβ1-42+miR-con組相比，Aβ1-42+miR-195組PC12細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著降低（t=10.88，P＜0.001；t=8.22，P＜0.001），miR-195表達(dá)顯著升高（t=44.43，P＜0.001）。見表2。

表2 miR-195過表達(dá)對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子分泌的影響∕±s

表2 miR-195過表達(dá)對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子分泌的影響∕±s

注：miR-195為微小RNA-195，Aβ為β樣淀粉蛋白，IL-1β為白細(xì)胞介素1β，TNF-α為腫瘤壞死因子α。①與Ccontrol組比較，P＜0.05。②與Aβ1-42+miR-con組比較，P＜0.05。

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2.3 過表達(dá)miR-195影響寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率和凋亡率與Control組相比，Aβ1-42組PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低（t=15.70，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=20.19，P＜0.001）；與Aβ1-42+miR-con組相比，Aβ1-42+miR-195組PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著升高（t=8.41，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著降低（t=8.80，P＜0.001）。見表3，圖2。

圖2 miR-195過表達(dá)對Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率的影響

表3 miR-195過表達(dá)對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率和凋亡率的影響∕（%，±s）

表3 miR-195過表達(dá)對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率和凋亡率的影響∕（%，±s）

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與Aβ1-42+miR-con組比較，P＜0.05。

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2.4 miR-195靶向調(diào)控ATP13A2miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示miR-195與ATP13A2 3′UTR存在互補(bǔ)核苷酸序列，見圖3A；野生型ATP13A2和miR-195共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對熒光活性顯著低于野生型ATP13A2和miR-NC共轉(zhuǎn)染組（t=10.61，P＜0.001），突變型ATP13A2和miR-195共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對熒光活性與突變型ATP13A2和miR-NC共轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.26，P=0.216），見表4；miR-195組細(xì)胞中ATP13A2蛋白水平（0.18±0.03）顯著低于miR-NC組（0.39±0.04），t=9.78，P＜0.001，anti-miR-195組細(xì)胞中ATP13A蛋白水平（0.70±0.07）顯著高于anti-miR-NC組（0.42±0.03），t=13.04，P＜0.001。四組比較，F(xiàn)=197.89，P＜0.001，見圖3B。

圖3 miR-195靶向ATP13A2：A為miR-195與ATP13A2的3’UTR之間存在互補(bǔ)的核苷酸序列；B為miR-195負(fù)向調(diào)控ATP13A2的蛋白表達(dá)

表4 雙熒光素酶報告實驗∕±s

表4 雙熒光素酶報告實驗∕±s

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2.5 沉默ATP13A2影響寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子分泌以及細(xì)胞存活和凋亡相較于Control組，Aβ1-42組PC12細(xì)胞中ATP13A2蛋白水平顯著升高（t=10.64，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量顯著升高（t=17.03，P＜0.001；t=20.119，P＜0.001），細(xì)胞活性顯著降低（t=15.27，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=21.34，P＜0.001）；與Aβ1-42+si-con組相比，Aβ1-42+si-ATP13A2組PC12細(xì)胞中ATP13A2蛋白表達(dá)顯著降低（t=7.39，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量顯著降低（t=11.42，P＜0.001；t=10.22，P＜0.001），細(xì)胞活性顯著升高（t=8.07，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著降低（t=7.01，P＜0.001）。見圖4，表5。

表5 抑制ATP13A2影響寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子的分泌、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡∕±s

表5 抑制ATP13A2影響寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子的分泌、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡∕±s

注：Aβ為β樣淀粉蛋白，IL-1β為白細(xì)胞介素1β，TNF-α為腫瘤壞死因子α。①與Control組比較，P＜0.05。②與Aβ1-42+si-con組比較，P＜0.05。

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圖4 抑制ATP13A2的寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞

2.6 過表達(dá)miR-195和過表達(dá)ATP13A2對寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子的分泌和細(xì)胞凋亡的影響相較于Aβ1-42+miR-con組，Aβ1-42+miR-195組PC12細(xì)胞中ATP13A2蛋白水平顯著降低（t=11.26，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量顯著降低（t=14.66，P＜0.001；t=9.676，P＜0.001），細(xì)胞活性顯著升高（t=9.44，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著降低（t=21.34，P＜0.001）；與Aβ1-42+miR-195+pcDNA組相比，Aβ1-42+miR-195+pcDNA-ATP13A2組PC12細(xì)胞中ATP13A2蛋白表達(dá)顯著升高（t=6.43，P＜0.001），IL-1β、TNF-α的含量顯著升高（t=7.22，P＜0.001；t=6.271，P＜0.001），細(xì)胞活性顯著降低（t=6.37，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=7.01，P＜0.001）。見表6，圖5。

表6 過表達(dá)miR-195和過表達(dá)ATP13A2對寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子的分泌、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的影響∕±s

表6 過表達(dá)miR-195和過表達(dá)ATP13A2對寡聚態(tài)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子的分泌、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的影響∕±s

注：Aβ為β樣淀粉蛋白，IL-1β為白細(xì)胞介素1β，TNF-α為腫瘤壞死因子α。①與Aβ1-42+miR-con組比較，P＜0.05。②與Aβ1-42+miR-195+pcDNA組比較，P＜0.05。

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圖5 過表達(dá)miR-195和過表達(dá)ATP13A2的寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ATP13A2的表達(dá)

3 討論

miRNA在人類的多種疾病中均具有重要作用，其中包括阿爾茨海默病。鮑晨曦等［11］發(fā)現(xiàn)，miR-195是精神分裂癥病人中差異表達(dá)的miRNA之一，我們推測miR-195可能與精神損傷的發(fā)病具有一定的相關(guān)性。Zhu等［12］在研究中報道，miR-195可降低了β-分泌酶（BACE1）的表達(dá)水平，并且miR-195的抑制可導(dǎo)致BACE1蛋白水平的增加，此外，在N2a∕APP中過表達(dá)miR-195降低了Aβ的水平，而miR-195的抑制導(dǎo)致Aβ的增加，揭示了miR-195可通過抑制BACE1的翻譯來下調(diào)Aβ的水平，提示miR-195可能為阿爾茨海默病提供治療策略，推測miR-195在阿爾茨海默病中低表達(dá)。瞿準(zhǔn)等［13］在創(chuàng)傷性腦損傷的研究中報道，miR-195的表達(dá)異常升高，抑制miR-195的表達(dá)改善腦損傷病人神經(jīng)功能，這為靶向miRNA治療臨床創(chuàng)傷性腦損傷提供了理論依據(jù)。本研究通過qRT-PCR法檢測到Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中miR-195表達(dá)水平明顯降低，這與Zhu等［12］的研究結(jié)果相一致；此外，過表達(dá)miR-195可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中IL-1β、TNF-α的表達(dá)，說明過表達(dá)miR-195對阿爾茨海默病具有抗炎的功能，除此之外，細(xì)胞存活率明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，揭示過表達(dá)miR-195對阿爾茨海默病細(xì)胞具有促進(jìn)增殖，抗凋亡作用，提示miR-195在阿爾茨海默病治療中的潛在價值；深入研究發(fā)現(xiàn)miR-195靶向負(fù)調(diào)控ATP13A2表達(dá)，這為miR-195在阿爾茨海默病中的機(jī)制探索提供參考。

由于生物醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者報道，遺傳性因素在PD的產(chǎn)生和發(fā)展中的重要作用。目前研究中與PD相關(guān)的較熱門的基因有ATP13A2、Parkin、LRRK2、PARK16等。大量研究報道，ATP13A2在帕金森病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［14-17］。但ATP13A2在阿爾茨海默病中的作用及調(diào)控機(jī)制報道鮮少。據(jù)報道，ATP13A2可作為miR-199a的靶基因參與6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程［18］。miR-4306靶向ATP13A2參與了錳暴露引起的神經(jīng)退行性變的調(diào)控［19］。本研究通過qRT-PCR法、Western blotting法檢測Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ATP13A2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ATP13A2的表達(dá)水平明顯地升高，這與張百平等［18］的實驗結(jié)果相一致；進(jìn)一步通過ELISA法、MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默ATP13A2的Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，沉默ATP13A2可下調(diào)Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中IL-1β、TNF-α的含量和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖，揭示沉默ATP13A2具有與過表達(dá)miR-195相同的保護(hù)Aβ 1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用，這是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)ATP13A2不僅對帕金森病的進(jìn)展具有重要作用，其對阿爾茨海默病的炎癥、增殖、凋亡過程均具有重要作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ATP13A2可逆轉(zhuǎn)miR-195對Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性因子分泌、增殖、凋亡的影響，這說明ATP13A2不僅受miR-195的靶向調(diào)控，還可逆向反作用miR-195對Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，為miR-195在神經(jīng)退行性疾病中的靶向治療提供參考依據(jù)。

綜上所述，miR-195靶向ATP13A2可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡。miR-195和ATP13A2可能是治療阿爾茨海默病的新靶點(diǎn)。