劉歡，曹袁媛，張雷，劉學(xué)勝，顧爾偉

目前，機(jī)械通氣（mechanical ventilation，MV）作 為重要的生命支持手段之一，在全身麻醉和危重病人的治療中發(fā)揮著重要作用。不恰當(dāng)?shù)臋C(jī)械通氣可能導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥，如呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）。既往研究表明，長時(shí)間的機(jī)械通氣可誘導(dǎo)局部肺組織產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)，破壞肺泡毛細(xì)血管屏障功能，導(dǎo)致肺水腫［1-2］。然而，機(jī)械通氣所致肺損傷的機(jī)制尚不清楚，也無治療VILI的好方法。VILI引起的嚴(yán)重術(shù)后肺部并發(fā)癥可導(dǎo)致住院時(shí)間、ICU住院率、死亡率和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)顯著增加［3-4］。因此，探討VILI相關(guān)免疫因子和信號(hào)通路對(duì)于預(yù)防和改善呼吸機(jī)通氣病人術(shù)后肺功能具有重要意義。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法對(duì)VILI基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選VILI發(fā)生過程中重要的免疫因子及可能的信號(hào)通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料在美國國家生物技術(shù)信息中心（http：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gds∕）的基因表達(dá)總庫（GEO）檢索2019年12月前與VILI相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，下載GSE86229基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析，該芯片表達(dá)譜基于GPL6246平臺(tái)（MoGene-1_0-st）Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array。選擇基因表達(dá)譜中兩組數(shù)據(jù)，非機(jī)械通氣組（對(duì)照組）樣本5個(gè)，高潮氣量組樣本5個(gè)。此外，從Bioconductor（www.bioconductor.org）下 載 探 針 注 釋 包（mogen10sttransptcluster.db）用于將數(shù)據(jù)的探針名稱映射為基因名稱［5］。

1.2 研究方法

1.2.1數(shù)據(jù)處理使用R軟件中的“affy”包通過RMA算法對(duì)基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括背景校正、歸一化和表達(dá)值計(jì)算，并繪制原始數(shù)據(jù)和處理后數(shù)據(jù)的箱線圖，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。然后，使用R軟件的“annotate”包將兩組數(shù)據(jù)探針名稱注釋為基因名稱進(jìn)行后續(xù)分析［6］。對(duì)于數(shù)據(jù)中映射多個(gè)探針名稱的基因，選擇最大探針表達(dá)值作為該基因的表達(dá)值。

1.2.2差異表達(dá)基因分析通過R軟件的“l(fā)imma”包篩選DEGs［7］，標(biāo)準(zhǔn)為adj.P.val＜0.05和|Log2FC|＞1。然后，通過“Pheatmap”包（https：∕∕cran.r-project.org∕package=pheatmap）進(jìn)行聚類分析和繪制熱圖，進(jìn)一步分析DEGs。

1.2.3DEGs的富集分析使用基因本體論（gene ontology，GO）分析對(duì)基因進(jìn)行功能注釋［8］，包括生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）三個(gè)方面。京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫包含許多生化通路，可以為生命科學(xué)研究提供更多的生物信息。使用在線數(shù)據(jù)庫Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID；version 6.8）進(jìn)行GO和KEGG分析［9］。閾值設(shè)置為Bonferroni校正P＜0.05，富集計(jì)數(shù)＞2。

1.2.4蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析在線數(shù)據(jù)庫STRING（string；version11.0；http：∕∕www.string-db.org∕）可從已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)中獲得蛋白質(zhì)全面相互作用信息［10］。研究中選擇高置信系數(shù)（＞0.7）作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，通過Cytoscape（3.5.0）軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化［11］，并通過插件cytoHubba尋找關(guān)鍵蛋白質(zhì)以確定與VILI發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理本研究中，基于GPL6246平臺(tái)的GSE86229基因表達(dá)譜芯片經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化和注釋，共獲得了20 310個(gè)基因。繪制對(duì)照組和高潮氣量組所有基因標(biāo)準(zhǔn)化前后的對(duì)數(shù)表達(dá)值箱線圖（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)化后，組內(nèi)和組間數(shù)據(jù)的中位數(shù)水平近似同一水平，表明不同芯片間的數(shù)據(jù)具有可比性，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)預(yù)處理：A為標(biāo)準(zhǔn)化前數(shù)據(jù)；B為標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)

2.2 差異表達(dá)基因分析在對(duì)照組和高潮氣量組之間共篩選出337個(gè)DEGs（高潮氣量組∕對(duì)照組），其中包括279個(gè)上調(diào)基因和58個(gè)下調(diào)基因（圖2A）。通過構(gòu)建基因熱圖進(jìn)行聚類分析（圖2B），結(jié)果顯示DEGs主要聚類為兩組：對(duì)照組和高潮氣量組，與基因表達(dá)譜芯片分組一致，表明納入的組內(nèi)樣本之間存在較高的同質(zhì)性。

圖2 呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷基因表達(dá)譜差異表達(dá)基因分析：A為火山圖；B為熱圖

圖3 呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷基因表達(dá)譜差異表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白質(zhì)分析

2.3 DEGs的富集分析337個(gè)DEGs主要富集在46個(gè)GO和13個(gè)KEGG類型中（見表1）。結(jié)果表明，DEGs顯著分布于細(xì)胞外間隙和細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)，主要參與細(xì)胞對(duì)炎癥、脂多糖和中性粒細(xì)胞趨化的生物過程，以及具有細(xì)胞因子活性、趨化因子活性和脂多糖結(jié)合的分子功能。KEGG分析表明DEGs主要富集在腫瘤壞死因子和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路途徑中。

表1 呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷基因表達(dá)譜差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析（前3位）

2.4 蛋白質(zhì)相互作用分析使用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)DEGs進(jìn)行分析，將獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape。刪除網(wǎng)絡(luò)無連接的節(jié)點(diǎn)后，獲得158個(gè)節(jié)點(diǎn)（蛋白質(zhì)）和745個(gè)PPI邊。通過cytoHubba插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白質(zhì)，不同算法獲取的關(guān)鍵蛋白質(zhì)見表2；取各算法結(jié)果交集，最終獲得白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、整聯(lián)蛋白αM（ITGAM）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和Toll樣受體2（TLR-2）作為關(guān)鍵蛋白質(zhì)。

表2 cytoHubba不同算法篩選的呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷基因表達(dá)譜關(guān)鍵蛋白質(zhì)

3 討論

隨著目前社會(huì)科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因芯片技術(shù)已成為研究生物科學(xué)的重要基石?；蛐酒酶咄糠肿由飳W(xué)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)數(shù)以萬計(jì)的基因表達(dá)情況，并可以通過生物信息學(xué)分析處理大量煩瑣的生物數(shù)據(jù)，為生命科學(xué)研究提供一定的幫助［12］。目前機(jī)械通氣所致肺損傷的機(jī)制尚不清楚，因此明確VILI相關(guān)免疫因子和信號(hào)通路對(duì)于預(yù)防和改善呼吸機(jī)通氣病人術(shù)后肺功能具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)基于GPL6246平臺(tái)的小鼠VILI肺組織樣本基因表達(dá)譜（GSE86229）進(jìn)行分析，篩選了337個(gè)DEGs。通過富集分析明確DEGs參與炎癥反應(yīng)過程；KEGG分析表明DEGs主要富集在TNF信號(hào)通路途徑。最終，通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)確定IL-6、TNF-α、ITGAM、IL-1β和TLR-2為關(guān)鍵蛋白質(zhì)，并確定IL-6、TNF-α、ITGAM、IL-1β和TLR-2為VILI發(fā)展的關(guān)鍵基因。

機(jī)械通氣已廣泛應(yīng)用于各種臨床環(huán)境，但大量的實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)表明盡管有保護(hù)性的小潮量通氣，機(jī)械通氣仍可導(dǎo)致VILI的發(fā)生［13］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要參與細(xì)胞對(duì)炎癥、脂多糖和中性粒細(xì)胞趨化的生物過程，以及具有細(xì)胞因子活性、趨化因子活性和脂多糖結(jié)合的分子功能。與本研究結(jié)果相似的是，雖然很多因素被認(rèn)為是VILI的可能危險(xiǎn)因素，但炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是共同的途徑［14-15］。研究普遍認(rèn)為機(jī)械通氣所致的損傷，包括氣壓傷、容積傷和肺不張傷，很可能發(fā)展為局部的炎癥失衡，甚至全身性炎癥反應(yīng)；表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤增加、肺泡壁增厚與透明膜形成等［16］。

IL-6作為一種功能廣泛的炎性因子，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。小鼠高潮氣量與低潮氣量機(jī)械通氣相比，可導(dǎo)致IL-6水平顯著升高；臨床研究也發(fā)現(xiàn)給予大潮氣量機(jī)械通氣病人與接受小潮氣量機(jī)械通氣病人相比，血漿中IL-6水平顯著升高高［17］。此外，不恰當(dāng)?shù)臋C(jī)械通氣也導(dǎo)致VILI的病人肺泡灌洗液中IL-6水平升高［18］。Meta分析結(jié)果顯示IL-6基因與急性肺損傷的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［19］。

炎癥細(xì)胞產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子（如TNF-α）進(jìn)一步加重肺損傷［20-22］。在VILI動(dòng)物模型中，高潮氣量及周期性的氣道關(guān)閉和重新開放都與肺泡灌洗液中TNF-α水平的增加有關(guān)。高潮氣量機(jī)械通氣顯著增加TNF-α的產(chǎn)生；提示TNF-α的上調(diào)在機(jī)械拉伸引起的肺部炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。Veldhuizen等［24］對(duì)離體小鼠肺臟進(jìn)行潮氣量為20 mL∕kg的機(jī)械通氣可顯著增加支氣管肺泡灌洗液中TNF-α水平。此外，通過抗體阻斷TNF-α功能可減輕肺泡表面活性物質(zhì)缺乏大鼠的組織病理學(xué)損傷［25］。這些數(shù)據(jù)提示TNF-α在VILI中的關(guān)鍵作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)IL-1β與VILI密切相關(guān)，肺內(nèi)IL-1β的水平在機(jī)械通氣過程中顯著升高［26-27］。小鼠使用高潮氣量機(jī)械通氣可導(dǎo)致支氣管肺泡灌洗液中IL-1β水平明顯升高［28］。此外，高潮氣量機(jī)械通氣增加血漿中炎性因子IL-1β水平［29］。然而，對(duì)敲除IL-1αβ基因后的小鼠進(jìn)行機(jī)械通氣并沒有表現(xiàn)出這種細(xì)胞因子的增加［26］。這些數(shù)據(jù)表明IL-1β參與了VILI的發(fā)生和發(fā)展。ITGAM為整聯(lián)蛋白αM，主要在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并參與吞噬、細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷、趨化和細(xì)胞激活功能［30］。細(xì)胞受到刺激時(shí)，ITGAM表達(dá)量增加。大鼠VILI模型中肺灌洗液發(fā)現(xiàn)單個(gè)巨噬細(xì)胞ITGAM的表達(dá)增加［31］。TLR-2作為天然免疫系統(tǒng)中的一種模式識(shí)別受體，在VILI模型中表達(dá)明顯上調(diào)，從而導(dǎo)致肺部炎癥［32］，使用TLR-2單克隆抗體拮抗TLR-2后可減輕VILI模型中肺臟的炎癥反應(yīng)［33］。

本研究中KEGG分析表明DEGs主要富集在TNF信號(hào)通路途徑。TNF-α是一種主要由感染或傷害的反應(yīng)激活的巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子［34］，其在炎癥、免疫反應(yīng)和多種病理生理過程中都起到重要的調(diào)節(jié)作用。TNF-α的這些功能均是通過TNF-α在細(xì)胞膜表面的受體介導(dǎo)的。TNF-α的受體有兩種，即Ⅰ型TNF受體（TNFR1）和Ⅱ型TNF受體（TNFR2）［35］。這兩種受體在不同類型的細(xì)胞中均有表達(dá)，TNFR1主要在上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)，而TNFR2在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)。TNF-α與TNFR1結(jié)合不僅傳遞細(xì)胞毒信號(hào)，還傳遞抗凋亡信號(hào)，而TNF-α與TNFR2結(jié)合僅傳遞抗凋亡信號(hào)［35］。p-38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲蘇氨酸蛋白激酶超家族，是將細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)傳遞至細(xì)胞核并引起細(xì)胞核發(fā)生變化的重要物質(zhì)。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）作為真核細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，通過磷酸化與去磷酸化的形式來實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄功能，其與細(xì)胞生長、增殖、分化、周期調(diào)控等細(xì)胞生物活動(dòng)密切相關(guān)。目前已報(bào)道CREB在炎癥過程的關(guān)鍵作用［36-37］。因此，我們推測(cè)TNF-α可能與細(xì)胞膜TNFR1結(jié)合，通過MAPK途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最后經(jīng)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CREB調(diào)控VILI發(fā)展的炎癥過程。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)分析方法篩選了VILI發(fā)生過程中的337個(gè)DEGs，通過蛋白質(zhì)相互作用分析確定IL-6、TNF-α、ITGAM、IL-1β和TLR-2是VILI發(fā)生的關(guān)鍵免疫因子；KEGG分析表明DEGs主要富集在TNF信號(hào)通路途徑，推測(cè)TNFR1-p38-CREB可能是VILI發(fā)展的信號(hào)通路之一。然而，本文的結(jié)果存在一定的局限性，需要未來進(jìn)一步的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

（本文圖2，3見插圖1-1）