趙增艷 韋彩雯 張源 程林芳 靳昌忠

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院1全科醫(yī)學科，2神經(jīng)內(nèi)科（上海202150）；3浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室（杭州310003）

HIV-1 感染者進展到艾滋病階段的一個重要特征是存在廣泛的非特異T 細胞慢性免疫激活，并能夠被抗病毒治療在一定程度上抑制［1-2］。許多T細胞免疫激活分子的表達與HIV-1感染密切相關(guān)，如CD38 和HLA-DR 等T 細胞激活標記［3-4］。由于HIV-1 難以清除并以低水平持續(xù)存在，長期刺激T 細胞激活進而導致其增殖和應答能力的缺失，即免疫耗竭［5-7］。miRNA 是細胞內(nèi)一類沒有編碼能力的RNA，在免疫細胞發(fā)育和免疫功能調(diào)控中有重要作用［8-10］。miR-155 近年來被發(fā)現(xiàn)是T 細胞功能分化的重要調(diào)控因子，可以調(diào)控CD4+T 細胞分化為不同的功能亞群，參與CD8+T 細胞的激活過程［9-10］。此外，miR-155 與HIV-1 感染密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1 感染者血漿中的miR-155水平與HIV-1 疾病進展程度有關(guān)，長期不進展者顯著較低［11-13］。此外，miR-155 還可以通過其它機制來抑制HIV-1 的感染，例如降低HIV-1 感染所需的宿主蛋白的表達水平等［14-15］。目前對于miR-155 在HIV-1 感染者T 細胞免疫應答中的作用尚未明確，已有研究多是體外研究，基于HIV-1 感染者隊列的體內(nèi)研究較少。鑒于T 細胞免疫狀態(tài)對HIV-1 感染的重要性以及miR-155 在T 細胞功能調(diào)控中的重要作用，本文重點研究HIV-1 感染者miR-155 與T 細胞免疫激活和耗竭的關(guān)系，為臨床免疫狀況評估提供重要的參考指標。

1 材料與方法

1.1 一般資料147 例HIV-1 感染者來自門診確診患者，抗病毒治療1年以上，選取58 例體檢者納入健康對照組。排除合并其它感染、血液或免疫性疾病者，以及近期使用免疫抑制劑或其它對T 細胞功能有影響的藥物的患者。HIV-1 感染者根據(jù)《中國艾滋病診療指南（2018 版）》［16］按照免疫學療效分為治療有效組（71 例）和治療無效組（76 例）。所有參與者均知情同意，研究方案通過浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2 miR-155檢測抽取患者5 mL抗凝血，分離外周血單個核細胞并用免疫磁珠（德國美天旎公司）分選CD4+和CD8+T細胞后，使用Qiagen RNeasy Micro Kit 試劑盒（德國凱杰公司）提取細胞總RNA。使用Takara 熒光定量PCR 試劑（大連寶生物公司）和人miR-155 特異性引物（廣州銳博公司）進行一步法定量PCR 檢測T 細胞內(nèi)miR-155 水平，內(nèi)參為U6 RNA，根據(jù)CT 值計算miR-155 相對表達水平。

1.3 流式細胞術(shù)使用美國BD 公司FACScanto Ⅱ流式細胞儀，抗人CD3-PE-Cy7、抗人CD38-FITC、抗人CD4-PE、抗人CD8-APC 和抗人PD-1-FITC 抗體購自BD 公司，抗體組合方案如下：CD3+CD4+CD8+CD38+和CD3+CD4+CD8+PD-1。每管取50 μL全血與抗體室溫避光孵育15 min 后裂解紅細胞，上機檢測。

1.4 HIV-1 RNA 定量檢測HIV-1 病毒載量檢測使用羅氏cobas AmpliPrep/cobas TaqMan 病毒載量檢測系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）進行，檢測下限為20 copies/mL。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0 軟件，組間比較采用t或χ2檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Pearson 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較治療有效組CD4+T 細胞為（584.87 ± 242.43）/μL，高于治療無效組（374.89 ±193.46）/μL（P＜0.01），CD8+T 細胞治療有效組（548.23 ± 331.45）/μL 低于治療無效組（865.38 ±213.56）/μL，（P＜0.01）。見表1。

表1 HIV-1 感染者及健康對照組臨床信息和實驗室指標比較Tab.1 Comparison of clinical information and laboratory indexes between HIV-1 infected subjects and healthy controls x±s

2.2 外周血miR-155 水平比較治療無效組CD4+和CD8+T 細胞miR-155 水平分別為（47.53±11.30）和（67.98 ± 22.73），顯著高于治療有效組［（23.87 ±6.54）vs.（34.69 ± 12.78）］和健康對照組［（12.76 ±5.35）vs.（17.87±9.65）］（均P＜0.05）。見表1。

2.3 T 細胞免疫激活和耗竭水平比較治療無效組CD4+和CD8+T 細胞免疫激活水平（CD38+%）最高，分別為（43.88±14.92）%和（56.93±15.79）%，治療有效組分別為（27.42±8.65）%和（38.87±9.13）%，高于健康對照組（P＜0.01）。見表1。

治療無效組T 細胞免疫耗竭水平（PD-1+%）最高，分別為（37.82 ± 16.48）%和（44.68 ± 20.37）%，治療有效組T 細胞免疫耗竭水平亦高于健康對照組，除治療有效組CD4+PD-1+%與健康對照之間差異外，其余差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.4 外周血T 細胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭指標的相關(guān)性分析HIV-1 感染者T 細胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭正相關(guān)（P＜0.05），健康對照組T 細胞miR-155 與細胞激活呈正相關(guān)（P＜0.05），與免疫耗竭相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。見表2。

表2 外周血T 細胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭指標的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of miR-155 level and immune activation and exhaustion in T cells

3 討論

有效的抗病毒治療能夠?qū)Ω腥菊叩拿庖吖δ芎蜖顟B(tài)起到一定的恢復作用［17-18］。除了CD4+T 細胞數(shù)量和比例這一經(jīng)典指標外，T 細胞免疫激活、耗竭等指標及其調(diào)控因素對判斷HIV-1 感染者免疫狀態(tài)有重要的臨床價值［19-20］。本文通過對抗病毒治療有效和無效的HIV-1 感染者以及健康對照進行橫斷面觀察研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1 感染者T 細胞miR-155 表達、免疫激活和耗竭水平均顯著升高，以治療無效者更顯著，miR-155 與免疫激活和耗竭水平正相關(guān)。這表明HIV-1 感染能提高T 細胞miR-155 表達，并影響T 細胞激活和耗竭水平，有效的抗病毒治療可以部分逆轉(zhuǎn)這一改變。但研究未發(fā)現(xiàn)miR-155 與HIV-1 載量存在直接相關(guān)性。

miR-155 可以通過多種機制影響HIV-1 感染。有研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者效應型調(diào)節(jié)性T 細胞miR-155表達水平高于未感染者［11-12］。miR-155能降低樹突狀細胞表面協(xié)同受體的表達以抑制HIV-1的感染能力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 可通過調(diào)節(jié)T 細胞免疫激活和耗竭水平來影響感染的進展。持續(xù)的非特異性T 細胞免疫激活是HIV-1 感染造成T 細胞免疫功能缺陷的主要因素［21］。miR-155能夠調(diào)節(jié)CD8+T 細胞不同亞群的增殖和分化，維持記憶型和效應記憶型CD8+T 細胞的比例［22］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-155 對于維持HIV-1 感染者的CD4+T 細胞的免疫激活狀態(tài)也很重要。PD-1 是一種免疫抑制性受體，與T 細胞免疫耗竭相關(guān)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 感染者T 細胞表面PD-1 表達升高，有效的抗病毒治療能夠部分降低PD-1 的表達水平，這與既往研究一致［21］。但本研究并沒有發(fā)現(xiàn)T 細胞表面PD-1 表達水平與病毒載量和CD4+T 細胞數(shù)存在相關(guān)性，而是與miR-155 相關(guān)，提示miR-155可能參與了T 細胞的免疫耗竭調(diào)控。

本研究存在一定的局限性，僅對HIV-1 感染者的T 細胞免疫狀態(tài)和miR-155 水平等指標進行了橫斷面研究，僅揭示了miR-155 與T 細胞免疫激活和耗竭的相關(guān)性，未闡明三者間的因果關(guān)系和相互作用機制。許多問題還有待于通過隊列隨訪和機制研究進一步探索。如T 細胞的免疫耗竭由免疫激活導致還是由miR-155 直接調(diào)控的機制，HIV-1感染是如何改變miR-155 表達水平，以及抗病毒治療恢復miR-155 水平和T 細胞免疫功能的原理。

總之，本研究結(jié)果提示miR-155 參與了HIV-1感染者T 細胞免疫激活和耗竭的調(diào)控，抗病毒治療能夠一定程度上抑制miR-155 表達水平并部分恢復T 細胞免疫功能。檢測T 細胞miR-155 水平可為臨床評估HIV-1 感染者T 細胞功能提供重要的參考。