文 張濤 朱孝天 肖立宏 .安徽東旭大別山農(nóng)業(yè)科技有限公司；.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

目的：研究野生油茶種質(zhì)遺傳的多樣性。方法：選取分辨力較強(qiáng)、多態(tài)性較高的19對(duì)引物組合，利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)（SPAP）對(duì)65份油茶種資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果：19對(duì)引物共擴(kuò)增出281條帶，多態(tài)性條帶為238條，多態(tài)性頻率為84.70%。此外，65份油茶種質(zhì)資源間的遺傳相似性變化范圍在0.59-0.96之間，在經(jīng)過(guò)聚類分析后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相似系數(shù)為0.64時(shí)，可以將65份資源分為6個(gè)類群。結(jié)論：野生油茶種植物種之間具有較為豐富的遺傳多樣性，在油茶育種、保護(hù)方面有著十分重要的作用。

山茶科山茶屬的油茶是我國(guó)特有的一種食用油本植物，其栽培的歷程較長(zhǎng)，大約有兩千年之久。同時(shí)，它也是世界上四大木本油料植物之一。此外，這種油茶中含有較多的不飽和脂肪酸，這些都是人體極其需要的物質(zhì)，這種油茶還有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健價(jià)值、藥用價(jià)值。因此，對(duì)這種野生種植油茶的遺傳多樣性研究十分重要。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）的新型分子標(biāo)記技術(shù)。對(duì)于這種技術(shù)而言，其穩(wěn)定性相對(duì)較高，在油茶的SRAP-PCR體系建立與優(yōu)化中應(yīng)用較為廣泛，在天然群體、優(yōu)良無(wú)性系的遺傳多樣性、種質(zhì)資源研究中較為常見(jiàn)。本文利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)（SPAP）對(duì)65份野生油茶種質(zhì)資源進(jìn)行了分析，旨為充分利用和挖掘油茶種質(zhì)資源提供參考依據(jù)，這對(duì)油茶品種的培育和栽培有重要作用。

1 .材料與方法

1.1 供試材料

選取具有代表性的65株野生油茶單株為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 CTAB法提取植物DNA

采用植物DNA的提取方法CTAB法提取油茶中的DNA，并使用稀釋的方式將其稀釋為100ng/μL，保存溫度為-20℃。

1.3 SRAP擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系

采用PTC-100PCR儀器來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用25μL反應(yīng)體系：1.25μL引物（25ng/μL）、1.25μL模板DNA（100ng/μL）、12.5μLMix、ddH2O補(bǔ)足25μL。

反應(yīng)程序：首先94℃5min繼續(xù)94℃1min，35℃1min，72℃1.5min，5個(gè)循環(huán)，94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，循環(huán)35次后，72℃延伸7min，在4℃溫度下保存。

1.4 篩選多態(tài)性引物組合

在篩選過(guò)程中，應(yīng)選擇擴(kuò)增條帶相對(duì)較好、重復(fù)性較高的143對(duì)SPAP引物來(lái)完成SPAP擴(kuò)增。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用“1”和“0”分別表示SRAP擴(kuò)增譜的有和無(wú)，并用多態(tài)性計(jì)算所獲取的數(shù)據(jù)；采用NTSYS-pc9（Version2.10e）計(jì)算相應(yīng)的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離；聚類圖的建立要按照非加權(quán)平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）進(jìn)行建立。

2 .結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增分析

在143對(duì)引物中篩選出19對(duì)SRPA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選的擴(kuò)增帶需豐富，并且具有較高的清晰度。在進(jìn)行相應(yīng)的PCR擴(kuò)增后，得到相應(yīng)的擴(kuò)增帶，詳見(jiàn)表1，并條帶的大小范圍在250-2000bp之間。其中，平均每條引物可以獲得擴(kuò)增條帶為14.9條，多態(tài)性條帶為238條，多態(tài)性頻率為84.70%，詳見(jiàn)表2。當(dāng)引物為E1/M11和E4/M7時(shí)，擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶為20條，相比較其他引物較多，如圖1所示。當(dāng)引物為E5/M7時(shí)，擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶為8條，相比較其他引物較少。經(jīng)過(guò)上述的分析表明：在經(jīng)過(guò)SRAP標(biāo)記后，其多態(tài)性相對(duì)較高、清晰度較好，在評(píng)價(jià)野生油茶種植資源多樣性方面有十分重要的作用。

圖1 以E4/M7為擴(kuò)增引物的SRAP圖譜

表1 用于野生油茶種質(zhì)SRAP分析的引物序列

表2 SRAP的引物擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)

2.2 遺傳多樣性分析

物種之間的基因變化情況可以通過(guò)分析遺傳多樣性指標(biāo)來(lái)確定。為了明確物種的起源以及預(yù)測(cè)物種的生長(zhǎng)趨勢(shì)，首先需對(duì)物種的遺傳多樣性進(jìn)行相應(yīng)的研究，這對(duì)物種的保存和培育有重要作用。

本次研究采用19對(duì)SRAP引物對(duì)65份野生油茶種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在經(jīng)過(guò)相應(yīng)的擴(kuò)增以后，得到其平均多肽頻率，大約為84.70%。其中，有兩對(duì)的多肽頻率相對(duì)較高，高達(dá)100%。在對(duì)E2/M9、E3/M8、E12/M10進(jìn)行擴(kuò)增分析后發(fā)現(xiàn)，其多肽頻率相對(duì)其它物種較低，發(fā)生這種情況的原因可能是與提供的材料有關(guān)。但是總體來(lái)說(shuō)，SRAP在評(píng)價(jià)油渣資源的遺傳多樣性方面十分關(guān)鍵，其評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性相對(duì)較高。對(duì)于一些差異相對(duì)較大的遺傳多樣性而言，其充分證明了本次研究具有相對(duì)較大的遺傳變異性，為油茶資源的收集提供了重要的依據(jù)，對(duì)后續(xù)的油茶資源培育和雜交育種有重要作用。

2.3 65份油茶種質(zhì)資源遺傳相似性分析

就遺傳相似性而言，其能夠準(zhǔn)確的判斷出油茶物種之間的親緣關(guān)系。在通過(guò)19對(duì)引物組合對(duì)65份油茶種質(zhì)資源進(jìn)行分析以后，發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性的變化范圍在處于0.59-0.96之間。其中遺傳相似性最高的達(dá)到0.96，說(shuō)明兩種材料之間的親緣關(guān)系相對(duì)較近，而遺傳相似性最低為0.59，說(shuō)明兩材料之間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.4 遺傳聚類分析

經(jīng)上述研究結(jié)果表明：在進(jìn)行的相應(yīng)的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)野生油茶的遺傳相似性似系數(shù)位于0.59-0.96范圍內(nèi)。其中，在系數(shù)為0.64時(shí)，可將其分為6各種群。此時(shí)，來(lái)自同一區(qū)域A的野生油茶主要是聚集在Ⅰ類種群中；來(lái)自區(qū)域B的野生油茶分別集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ類種群；C區(qū)域的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ類種群中，區(qū)域D的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類種群中。經(jīng)過(guò)相應(yīng)的研究表明，區(qū)域A、B中的野生油茶遺傳多樣性相比較C、D較低，但是卻具有較高的親緣關(guān)系。

3 .討論

本次研究選取分辨力較強(qiáng)、多態(tài)性較高的19對(duì)引物組合，利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)（SPAP）對(duì)65份油茶種資源進(jìn)行擴(kuò)增。在進(jìn)行擴(kuò)增以后，得到的多態(tài)性條帶較為豐富，并且清晰度和重復(fù)性較高，這充分說(shuō)明了野生油茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性比較豐富，并且容易育種和進(jìn)行遺傳改良。在進(jìn)行聚類分析后，發(fā)現(xiàn)野生油茶的遺傳相似性系數(shù)在0.59-0.96范圍內(nèi)，聚類結(jié)果充分說(shuō)明了野生油茶樣品之間存在相應(yīng)的遺傳差異性。此外，從分析結(jié)果中可以看出，當(dāng)植株屬于同一類群時(shí)，植株可能是來(lái)源于相同的區(qū)域中，也有可能是來(lái)自不同區(qū)域中，此種結(jié)果充分表明了野生油茶聚類分析并沒(méi)有考慮到植株的來(lái)源地，導(dǎo)致植株的親緣關(guān)系具有一定的復(fù)雜性。產(chǎn)生這種情況的原因主要有以下幾點(diǎn)：（1）不同植株之間進(jìn)行授粉、偶然的基因突變、在長(zhǎng)期的自然條件下，油茶為了更好的適應(yīng)環(huán)境，因此具有了多樣性的特征；（2）一部分的樣品沒(méi)有根據(jù)其地理區(qū)域進(jìn)行聚合，這可能是由于油茶自然分化時(shí)地理區(qū)域的影響小于遺傳漂移數(shù)量不均導(dǎo)致聚類結(jié)果不夠均勻。

綜上所述，本次研究選取的野生油茶種質(zhì)資源生產(chǎn)區(qū)域氣候比較適合油茶的生長(zhǎng)。但是在品種混亂以及粗放式管理的經(jīng)營(yíng)模式下，導(dǎo)致野生油茶的收益并不理想。因此，在未來(lái)的野生油茶育種和保護(hù)的過(guò)程中，需充分利用現(xiàn)有的野生油茶資源，并將其收入到資源庫(kù)中，使得其選擇基地規(guī)模變大。