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        SRAP標記的野生油茶種質遺傳多樣性研究

        2022-01-01 13:51:48張濤朱孝天肖立宏安徽東旭大別山農業(yè)科技有限公司安徽農業(yè)大學
        食品界 2022年12期
        關鍵詞:標記技術相似性條帶

        文 張濤 朱孝天 肖立宏 .安徽東旭大別山農業(yè)科技有限公司;.安徽農業(yè)大學

        目的:研究野生油茶種質遺傳的多樣性。方法:選取分辨力較強、多態(tài)性較高的19對引物組合,利用相關序列擴增多態(tài)性分子標記技術(SPAP)對65份油茶種資源進行遺傳多樣性分析。結果:19對引物共擴增出281條帶,多態(tài)性條帶為238條,多態(tài)性頻率為84.70%。此外,65份油茶種質資源間的遺傳相似性變化范圍在0.59-0.96之間,在經過聚類分析后發(fā)現(xiàn),當相似系數為0.64時,可以將65份資源分為6個類群。結論:野生油茶種植物種之間具有較為豐富的遺傳多樣性,在油茶育種、保護方面有著十分重要的作用。

        山茶科山茶屬的油茶是我國特有的一種食用油本植物,其栽培的歷程較長,大約有兩千年之久。同時,它也是世界上四大木本油料植物之一。此外,這種油茶中含有較多的不飽和脂肪酸,這些都是人體極其需要的物質,這種油茶還有較高的營養(yǎng)價值、保健價值、藥用價值。因此,對這種野生種植油茶的遺傳多樣性研究十分重要。

        相關序列擴增多態(tài)性是一種基于聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)的新型分子標記技術。對于這種技術而言,其穩(wěn)定性相對較高,在油茶的SRAP-PCR體系建立與優(yōu)化中應用較為廣泛,在天然群體、優(yōu)良無性系的遺傳多樣性、種質資源研究中較為常見。本文利用相關序列擴增多態(tài)性分子標記技術(SPAP)對65份野生油茶種質資源進行了分析,旨為充分利用和挖掘油茶種質資源提供參考依據,這對油茶品種的培育和栽培有重要作用。

        1 .材料與方法

        1.1 供試材料

        選取具有代表性的65株野生油茶單株為實驗材料。

        1.2 CTAB法提取植物DNA

        采用植物DNA的提取方法CTAB法提取油茶中的DNA,并使用稀釋的方式將其稀釋為100ng/μL,保存溫度為-20℃。

        1.3 SRAP擴增PCR反應體系

        采用PTC-100PCR儀器來進行PCR擴增,并采用25μL反應體系:1.25μL引物(25ng/μL)、1.25μL模板DNA(100ng/μL)、12.5μLMix、ddH2O補足25μL。

        反應程序:首先94℃5min繼續(xù)94℃1min,35℃1min,72℃1.5min,5個循環(huán),94℃1min,50℃1min,72℃1.5min,循環(huán)35次后,72℃延伸7min,在4℃溫度下保存。

        1.4 篩選多態(tài)性引物組合

        在篩選過程中,應選擇擴增條帶相對較好、重復性較高的143對SPAP引物來完成SPAP擴增。

        1.5 數據分析

        用“1”和“0”分別表示SRAP擴增譜的有和無,并用多態(tài)性計算所獲取的數據;采用NTSYS-pc9(Version2.10e)計算相應的遺傳相似系數和遺傳距離;聚類圖的建立要按照非加權平均法(unweighted pairgroup method with arithmetic means,UPGMA)進行建立。

        2 .結果與分析

        2.1 SRAP擴增分析

        在143對引物中篩選出19對SRPA引物進行PCR擴增,篩選的擴增帶需豐富,并且具有較高的清晰度。在進行相應的PCR擴增后,得到相應的擴增帶,詳見表1,并條帶的大小范圍在250-2000bp之間。其中,平均每條引物可以獲得擴增條帶為14.9條,多態(tài)性條帶為238條,多態(tài)性頻率為84.70%,詳見表2。當引物為E1/M11和E4/M7時,擴增出的多態(tài)性條帶為20條,相比較其他引物較多,如圖1所示。當引物為E5/M7時,擴增出的多態(tài)性條帶為8條,相比較其他引物較少。經過上述的分析表明:在經過SRAP標記后,其多態(tài)性相對較高、清晰度較好,在評價野生油茶種植資源多樣性方面有十分重要的作用。

        圖1 以E4/M7為擴增引物的SRAP圖譜

        表1 用于野生油茶種質SRAP分析的引物序列

        表2 SRAP的引物擴增條帶統(tǒng)計

        2.2 遺傳多樣性分析

        物種之間的基因變化情況可以通過分析遺傳多樣性指標來確定。為了明確物種的起源以及預測物種的生長趨勢,首先需對物種的遺傳多樣性進行相應的研究,這對物種的保存和培育有重要作用。

        本次研究采用19對SRAP引物對65份野生油茶種質資源進行PCR擴增,在經過相應的擴增以后,得到其平均多肽頻率,大約為84.70%。其中,有兩對的多肽頻率相對較高,高達100%。在對E2/M9、E3/M8、E12/M10進行擴增分析后發(fā)現(xiàn),其多肽頻率相對其它物種較低,發(fā)生這種情況的原因可能是與提供的材料有關。但是總體來說,SRAP在評價油渣資源的遺傳多樣性方面十分關鍵,其評價的準確性相對較高。對于一些差異相對較大的遺傳多樣性而言,其充分證明了本次研究具有相對較大的遺傳變異性,為油茶資源的收集提供了重要的依據,對后續(xù)的油茶資源培育和雜交育種有重要作用。

        2.3 65份油茶種質資源遺傳相似性分析

        就遺傳相似性而言,其能夠準確的判斷出油茶物種之間的親緣關系。在通過19對引物組合對65份油茶種質資源進行分析以后,發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性的變化范圍在處于0.59-0.96之間。其中遺傳相似性最高的達到0.96,說明兩種材料之間的親緣關系相對較近,而遺傳相似性最低為0.59,說明兩材料之間的親緣關系相對較遠。

        2.4 遺傳聚類分析

        經上述研究結果表明:在進行的相應的PCR擴增試驗后,發(fā)現(xiàn)野生油茶的遺傳相似性似系數位于0.59-0.96范圍內。其中,在系數為0.64時,可將其分為6各種群。此時,來自同一區(qū)域A的野生油茶主要是聚集在Ⅰ類種群中;來自區(qū)域B的野生油茶分別集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ類種群;C區(qū)域的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ類種群中,區(qū)域D的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類種群中。經過相應的研究表明,區(qū)域A、B中的野生油茶遺傳多樣性相比較C、D較低,但是卻具有較高的親緣關系。

        3 .討論

        本次研究選取分辨力較強、多態(tài)性較高的19對引物組合,利用相關序列擴增多態(tài)性分子標記技術(SPAP)對65份油茶種資源進行擴增。在進行擴增以后,得到的多態(tài)性條帶較為豐富,并且清晰度和重復性較高,這充分說明了野生油茶種質資源的遺傳多樣性比較豐富,并且容易育種和進行遺傳改良。在進行聚類分析后,發(fā)現(xiàn)野生油茶的遺傳相似性系數在0.59-0.96范圍內,聚類結果充分說明了野生油茶樣品之間存在相應的遺傳差異性。此外,從分析結果中可以看出,當植株屬于同一類群時,植株可能是來源于相同的區(qū)域中,也有可能是來自不同區(qū)域中,此種結果充分表明了野生油茶聚類分析并沒有考慮到植株的來源地,導致植株的親緣關系具有一定的復雜性。產生這種情況的原因主要有以下幾點:(1)不同植株之間進行授粉、偶然的基因突變、在長期的自然條件下,油茶為了更好的適應環(huán)境,因此具有了多樣性的特征;(2)一部分的樣品沒有根據其地理區(qū)域進行聚合,這可能是由于油茶自然分化時地理區(qū)域的影響小于遺傳漂移數量不均導致聚類結果不夠均勻。

        綜上所述,本次研究選取的野生油茶種質資源生產區(qū)域氣候比較適合油茶的生長。但是在品種混亂以及粗放式管理的經營模式下,導致野生油茶的收益并不理想。因此,在未來的野生油茶育種和保護的過程中,需充分利用現(xiàn)有的野生油茶資源,并將其收入到資源庫中,使得其選擇基地規(guī)模變大。

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