于金超 張?zhí)煊?/p>

(復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

瘢痕組織是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中自然形成的產(chǎn)物，理想的愈合應產(chǎn)生不太明顯的瘢痕。增生性瘢痕(hypertrophic scars，HTSs)是皮膚愈合過程中產(chǎn)生的病理狀態(tài)，其機制不甚明確，但在創(chuàng)傷愈合過程中炎癥期、增殖期和重塑期的任何一個階段產(chǎn)生調(diào)節(jié)異常，均可導致HTSs的發(fā)生。HTSs的病理特征表現(xiàn)為表皮層和真皮層增厚、角質細胞增生、大量成纖維細胞和肌成纖維細胞、血管增生、膠原組織含量和排列異常等[1]。全球每年有數(shù)百萬以上的人因各種原因而形成瘢痕[2]，嚴重燒傷后30%~90%患者會發(fā)展為HTSs[3]。大約70%的患者HTSs發(fā)生在關節(jié)附近或身體其他皮膚緊致部位，在受傷后6~12個月真皮發(fā)生纖維化，形成隆起、僵硬、發(fā)癢的瘢痕，產(chǎn)生瘢痕攣縮，嚴重影響美觀，并導致生活質量下降。HTSs形成過程中主要表現(xiàn)為皮膚過度纖維化增生，伴有過度的成纖維細胞增殖和異常膠原蛋白沉積。多種方法應用于HTSs的治療，包括傳統(tǒng)的壓迫治療、局部或全身應用糖皮質激素、抗腫瘤藥物局部注射、激光治療、手術切除、自體脂肪移植和放射治療等[2]。但迄今為止，尚未形成一個HTSs治療的金標準。自體脂肪移植由于移植物獲取簡易，且可進行注射移植，在組織修復和再生領域中引起了學者的關注和重視。自體脂肪移植和脂肪來源間充質干細胞(adipose-derived stem cell，ADSC)逐步應用于病理性瘢痕的治療。臨床研究和基礎性實驗證實ADSC可在HTSs的治療中發(fā)揮作用[4-5]，可以有效修復面部及身體的功能和美觀。但自體脂肪移植后改善瘢痕的基本機制尚未明確，由于脂肪注射量與瘢痕相比較小，注射后局部容積的變化并不能很好地解釋自體脂肪移植的抗瘢痕作用。因此，目前推測ADSC多向分化能力、自身分泌的可溶性因子、與瘢痕組織細胞之間的相互作用等，可能與其抗瘢痕作用有關。本文就自體脂肪移植治療HTSs的作用機制研究進展進行系統(tǒng)綜述。

1 ADSC的生物學特性

皮下脂肪組織主要由成熟的脂肪細胞和血管基質組分(stromal vascular fraction，SVF)組成，后者包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、前脂肪細胞、血管平滑肌細胞、淋巴細胞、單核細胞和ADSC等，SVF中64% 為ADSC[6]。自Zuk等[7]于2001年首次在抽脂手術后的脂肪組織中分離出ADSC后，ADSC在多個不同領域展現(xiàn)了其臨床應用潛力。ADSC來源廣泛，取材較易，具有自我更新、穩(wěn)定生長、組織修復和多向分化潛能等。成體干細胞缺乏特異性和通用的分子標記，必須使用多種分化的功能測定法來鑒定干細胞。用于標記ADSC的蛋白包括黏附分子、受體分子、表面酶、細胞外基質蛋白、糖蛋白和組織相容性抗原等[8-9]，但不表達造血細胞標記物，例如CD14、CD31、CD34和CD45[9]。ADSC具有可分化成中胚層、內(nèi)胚層和外胚層3個胚層的能力，包括脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)元細胞、心肌細胞、肝細胞、胰腺細胞和內(nèi)皮細胞等[8]，與骨髓干細胞相比，其軟骨分化能力弱。ADSC的克隆率高于骨髓干細胞，兩者之間具有相似的抑制T細胞增殖的能力。

2 ADSC的旁分泌作用

在特定的微環(huán)境中，ADSC可分泌大量特定生長因子、細胞因子或其他旁分泌因子等，促進傷口愈合。有研究[10]表明機械損傷可促進脂肪組織分泌成纖維細胞生長因子-2 (f ibroblast growth factor-2， FGF-2)、轉 化 生 長 因 子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)、表 皮 細 胞 生 長 因 子(epidemal growth factor，EGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等，而通過脂肪抽吸術獲取的脂肪移植物本身就是一種嚴重的損傷過程，其移植至修復部位后將啟動傷口愈合的級聯(lián)過程，ADSC及其分泌物在這一過程中起到了重要作用。FGF-2可上調(diào)HTSs成纖維細胞基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)和HGF的表達[11]，而阻斷FGF-2后可增加纖維化程度[12]。動物實驗也證實FGF-2可減輕瘢痕的形成[11]。PDGF與HTSs中成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化高度相關[13]。HGF可通過依賴JNK途徑在抑制纖維化過程中發(fā)揮重要作用，阻斷HGF后可增加纖維化程度[12]。HGF也可有效抑制纖維化相關因子，調(diào)節(jié)HTSs中 ECM重塑[14]。

白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是ADSC旁分泌的主要抗炎因子之一，與TGF-β和其他炎癥因子相比，IL-10可抑制纖維化[15]，發(fā)揮其抗瘢痕作用[16]，但其抗瘢痕的機制不甚明確，可能與降低炎癥反應、減少ECM形成和調(diào)節(jié)成纖維細胞的遷移、侵襲、轉化和凋亡等有關。IL-10也可能會下調(diào)IL-6和IL-8的表達，發(fā)揮其抗瘢痕形成作用[5]。也有研究[1,17]指出，IL-10的抗瘢痕作用可能與PI3K/AKT和STAT3信號通路或STAT3和AKT-mTOR信號通路之間相互影響有關。此外，IL-10可顯著下調(diào)Ⅰ型、Ⅲ型膠原和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，并上調(diào)MMP-1和MMP-8的表達[15]。

3 ADSC和TGF-β/ Smad信號通路的調(diào)節(jié)

TGF-β是一種多功能生長因子，包括TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3 3種亞型，與TGF-β Ⅰ型和Ⅱ型受體結合后[18]，誘導下游靶點Smad的激活，發(fā)揮生物學效應，在結締組織重塑和ECM基因表達調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)，在機械應力的作用下，瘢痕疙瘩成纖維細胞與正常皮膚成纖維細胞相比，mRNA和蛋白質水平均高表達TGF-β1、TGF-β2和膠原[19]。HTSs中的成纖維細胞高表達α-SMA，并可持續(xù)自分泌TGF-β1。TGF-β1也可促進α-SMA的表達[20]，α-SMA蛋白的表達與肌成纖維細胞的收縮密切相關。TGF-β1可刺激組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)的合成，進而抑制MMP介導的細胞外基質(extracellular matrices，ECM)的降解[18]。與TGF-β1在損傷后數(shù)分鐘即可由血小板釋放相比，TGF-β2和TGF-β3在損傷發(fā)生后24 h內(nèi)緩慢升高[18]。另外，TGF-β1主要在成人組織中表達，而胎兒組織中主要表達TGF-β3，TGF-β3可能與胎兒無瘢痕愈合相關。ADSC可顯著抑制TGF-β1和α-SMA的表達[5]，導致TGF-β/Smad信號通路中下游Smad2和Smad3磷酸化減少[5]，其磷酸化的減少在一定程度上阻斷了TGF-β1刺激成纖維細胞轉換為肌成纖維細胞的生物學效應，改善了瘢痕的形成。Zhang等[16]在動物實驗證實，在瘢痕模型病灶內(nèi)注射ADSC后，可降低α-SMA和Ⅰ型膠原的表達，并可以改善膠原蛋白沉積和排列，減少HTSs的形成。另有動物研究[21]發(fā)現(xiàn)，在ADSC注射到瘢痕組織后的早期會出現(xiàn)TGF-β3和MMP1的上調(diào)，晚期出現(xiàn)α-SMA和TIMP的減少。ADSC調(diào)節(jié)TGF-β1、TGF-β3以及相關信號通路中細胞因子的變化提示ADSC可能通過TGF-β/ Smad信號通路發(fā)揮其抗瘢痕作用。

4 ADSC和p38/MAPK信號通路的調(diào)節(jié)

p38/MAPK是一個經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，是細胞外信號傳送到細胞內(nèi)的一類重要信號通路，通過線粒體死亡途徑、細胞分化或血管緊張素Ⅱ的激活等影響HTSs的形成[22]。有研究表明ADSC-CM降低了Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-SMA的表達以及影響膠原蛋白的排列。ADSCCM處理的HTSs成纖維細胞中p-p38蛋白水平呈現(xiàn)濃度依賴性下調(diào)。加入p-p38抑制劑后可出現(xiàn)Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原和α-SMA表達的下降，p38的加入則出現(xiàn)相反的結果[22]。p38/MAPK信號通路可能是ADSC抗瘢痕的潛在機制之一。

5 ADSC的免疫調(diào)節(jié)作用

過度的炎癥反應是HTSs形成的一個重要因素。受傷即時血小板、激活的補體和凝血因子等形成纖維蛋白凝集塊，刺激炎癥細胞(中性粒細胞、巨噬細胞和肥大細胞等)募集，后者進一步產(chǎn)生促炎介質，包括巨噬細胞炎性蛋白-1α、MCP-1、調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌的活化因子、IL-1β和IL-6等。之后ECM的形成和重塑同樣有多種炎癥細胞和細胞因子參與其中，如前所述，TIMP和MMPs在ECM的降解中發(fā)揮重要作用。有文獻[21,23]報道ADSC在傷口愈合過程中具有減輕炎癥反應的作用。除了前面所提到的一些生長因子和抗炎因子外，ADSC也可自分泌前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)，PGE2可調(diào)控T細胞的增殖和分化[23]，抑制其免疫反應。與T細胞同時大量存在于活躍期瘢痕組織的肥大細胞和朗格漢斯細胞在脂肪注射后其數(shù)量明顯減少[21]。巨噬細胞在受傷早期即募集到傷口周圍，清理損傷細胞和異物等。在炎癥反應過程中巨噬細胞可進行M1型和M2型的轉換，ADSC可促進巨噬細胞由M1型轉換為M2型[24]。M1型高表達促炎性細胞因子，并可促進Th1細胞發(fā)揮功能；而M2型低表達促炎細胞因子和高表達抗炎細胞因子，可促進Th2細胞發(fā)揮功能。如M1型巨噬細胞存在時間較長則將不利于傷口的愈合，M1型轉換為M2型后有利于傷口愈合[23]。PGE2作用于T細胞后可促進Th1細胞向Th2細胞的轉換[25]，與巨噬細胞的轉型相互發(fā)揮協(xié)同作用，免疫細胞在炎癥后期的轉型對瘢痕增生和重塑起到了至關重要的作用。因此ADSC通過分泌抗炎因子、抑制炎癥介質分泌、促進免疫細胞轉型和減少免疫細胞的數(shù)量等聯(lián)合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

6 ADSC的抗氧化作用

組織受到損傷后，局部的低氧環(huán)境會導致氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，ROS對TGF-β1/Smad通路的激活和下游因子的調(diào)控有著積極的促進作用。Kim等[26]通過體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)了ADSC對皮膚纖維化的抗氧化作用，通過減少細胞凋亡來保護其免受氧化損傷。ADSC條件培養(yǎng)基中含有許多已知的抗氧化因子，包括胰島素樣生長因子、胎盤生長因子、PDGF，VEGF、FGF、HGF、IL-6、IL-8和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等。同時ADSC條件培養(yǎng)基可增強成纖維細胞中SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx)的 活 性。SOD和GPx是細胞內(nèi)抗氧化的重要分子。ADSC-CM也可有效清除過氧化氫并抑制脂質過氧化，并可影響成纖維細胞中MMPs和TIMP的表達[27]。ADSC在局部微環(huán)境的影響下可通過其抗氧化作用影響瘢痕的纖維化和重塑過程。

7 自體脂肪移植在瘢痕中的應用

1893年Gustav Neuber首次將手臂脂肪組織移植到眼眶以糾正骨髓炎后的瘢痕后遺癥。1974年Fisher提出了脂肪抽吸技術，隨后1985年Klein提出了腫脹液的應用更加促進了脂肪抽吸技術的發(fā)展。黃振等[28]前瞻性研究報道二氧化碳點陣激光聯(lián)合自體脂肪注射治療HTSs的有效率明顯高于單純激光治療，可明顯減輕疼痛、瘙癢癥狀，改善瘢痕外形美觀情況。王斐等[29]報道的80例瘢痕患者中乳糜脂肪移植組的術后溫哥華瘢痕量表(Vancouver scar scale，VSS)評分與術前相比，差異有統(tǒng)計學意義，而生理鹽水注射組的術后VSS評分與術前相比，差異無統(tǒng)計學意義。由此指出乳糜脂肪移植對HTSs有良好的治療效果，其作用可能與ADSC、ECM、脂肪前體細胞及其分泌的細胞因子等有關[29]。另一篇隨機對照試驗(randomized controlled trial，RCT)研究發(fā)現(xiàn)，自體脂肪移植術后，醫(yī)師客觀評估和患者自我評估均顯示出瘢痕狀況得到改善，但與生理鹽水對照組相比，瘢痕的硬度、彈性、顏色評分和血管走形，膠原的重塑，慢性炎癥等組織學指標均無明顯差異[30]。但同時這篇文獻也指出了自身存在的可能缺陷，包括入組數(shù)量較少(僅有17例)、單次自體脂肪移植、無其他治療，以及年齡、病因和部位等因素的不確定性等。多數(shù)文獻[4,28-29]報道自體脂肪移植治療為3次，但對治療次數(shù)和治療間隔時間目前并沒有統(tǒng)一的標準。亟須多中心、大樣本的RCT研究對自體脂肪移植治療HTSs進行分析對比。 Sataloff 等[31]首次報道了4例自體脂肪移植治療因聲帶瘢痕而引起言語障礙的患者，術后隨訪10個月~3年，嗓音質量得到改善。Neuenschwander 等[32]報道了8例因嚴重瘢痕和發(fā)音困難而進行脂肪移植的患者，平均隨訪時間為23個月，聲門關閉、黏膜波、僵硬程度和嗓音嘶啞評估(GRBAS)評分均有顯著改善。Cantarella等[33]報道了7例Nano 脂肪注射治療廣泛聲帶瘢痕引起的嚴重發(fā)音障礙患者，術后所有患者的嗓音質量和吞咽功能均得到改善。Kim等[34]將人ADSC注射到兔聲帶損傷瘢痕動物模型，評估其高速攝影、聲學功能性指標、蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學指標，與未進行ADSC注射組相比，ADSC改善了聲帶ECM和過度沉積的I型膠原。胡蓉等[35]研究ADSC移植到損傷聲帶后的分布及對聲帶固有層及ECM變化的影響，發(fā)現(xiàn)單純聲帶損傷3個月后局部出現(xiàn)瘢痕攣縮，大量纖維組織增生，持續(xù)至12個月；ADSC植入損傷聲帶后，形態(tài)6個月時接近正常，部分組織學結構在12個月時類似聲帶。ADSC可以促進ECM分泌并合理有序地分布和排列在聲帶固有層內(nèi)。聲帶脂肪注射是治療嚴重和(或)廣泛的聲帶瘢痕一種有效和實用的方法。

綜上所述，自體脂肪移植后改善瘢痕的作用機制可能是多種分子機制共同介導的。目前的研究多集中于ADSC通過旁分泌因子、多種不同信號通路相互影響作用于瘢痕組織成纖維細胞和ECM，對ADSC的多向分化潛能研究較少，間充質干細胞在創(chuàng)傷愈合的局部會分化成真皮細胞，但其在瘢痕組織微環(huán)境中是否會發(fā)生相似的變化目前不甚明了。ADSC對早期和晚期HTSs的抗纖維化作用機制是否不同，需要進一步深入的研究，在可靠的動物模型基礎上進行實驗驗證。在HTSs發(fā)生時進行干預阻斷其發(fā)生、發(fā)展過程，可較高水平提高患者的生活質量。自體脂肪移植物中抗纖維化的旁分泌因子(如TGF-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、HGF、bFGF等)可能是藥物治療HTSs的潛在靶點。