賈福運 高晟瑋 馬佳樂 秦云普 蘇禹如 朱婷婷 高望

通過近年來胃癌領域研究的不斷深入，誘發(fā)胃癌的分子信號通路已被熟知，其中以磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)及其下游的蛋白激酶B (protein kinase B，PKB/Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)組成的P13K/Akt/mTOR信號通路與胃癌關系密切[1]，當機體接收到外來傳導刺激后可激活P13K，激活的P13K聚集到鄰近的質膜上，將質膜上的底物4,5-磷脂酰肌醇二磷酸[phosphatidylinositol (4，5)bisphosphate，PIP2]磷酸化轉變成第二信使3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PIP3作為第二信使，能將Akt從細胞質轉變至細胞膜上，促使PDK1對Akt蛋白thr308端磷酸化，從而激活Akt[2]。活化后的Akt能阻滯二聚體復合物的產(chǎn)生進而激活下游的mTOR，因此，活化后的Akt、mTOR能通過下游多種途徑干預癌細胞增殖、凋亡等[3]。本文基于PI3K/Akt/mTOR信號通路，尋求通過中醫(yī)藥干預細胞凋亡、細胞自噬、抗腫瘤血管生成、調節(jié)靶向基因治療胃癌作用機制方面進行綜述，旨在為臨床提供理論參考。

1 誘導細胞凋亡

1.1 細胞凋亡與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系

細胞凋亡是被基因控制的細胞程序性死亡過程，在細胞內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)定中占據(jù)著重要作用,細胞凋亡異常是惡性轉化過程中的重要因素之一，因此，促進細胞凋亡被看作是腫瘤治療的有效靶點。其中B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartsate specific proteinase,Caspase))、抑癌基因p53(tumor suppressor gene,p53)是影響細胞凋亡的主要因素。Bcl-2家族蛋白是由抑制凋亡作用Bcl-2亞族蛋白、促進細胞凋亡Bax亞家和BH3亞家三部分亞族所組成；caspase在細胞凋亡中扮演啟動者和執(zhí)行者的作用，啟動者包含caspase-8、9、10，執(zhí)行者包含caspase-3、6、7等，其中caspase-3作為關鍵執(zhí)行分子,在凋亡過程中起到終末剪切酶的作用,它是多種凋亡途徑中常見的下游效應分子，在細胞凋亡的早期被激活，切割相應的底物，最終導致細胞凋亡[4]；p53屬于抑癌基因家族，能參與細胞周期的阻滯，在細胞衰老及凋亡中處于核心調節(jié)分子，同時對DNA損傷誘導細胞凋亡中也起到關鍵作用，通過p53誘導細胞凋亡能除去易產(chǎn)生的癌細胞[5]。PI3K/Akt/mTOR通路是一條經(jīng)典的抗凋亡明星信號通路，對多種相關細胞凋亡家族進行調控，可通過調節(jié)以下機制實現(xiàn)：(1)促進抗細胞凋亡蛋白的產(chǎn)生。Akt作為P13K的下游基因，Akt活化后可誘導促凋亡蛋白Bad磷酸化，促進Bad與Bcl-2或Bcl-xL的分離進而加速抗凋亡蛋白Bcl-2增加。(2)激活相關線粒體通路。激活后的Akt能在活化caspase-9前體的基礎上進一步抑制影響線粒體的激活途徑，從而干預細胞凋亡。(3)抑制凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)和細胞色素C的釋放，激活caspase家族。線粒體的通透性轉變孔被刺激時會發(fā)生相應的改變，可增加AIF的釋放，促使線粒體膜發(fā)生去極化，誘導細胞色素C的釋放，促進procaspase-9及procaspase-3活化進而激活caspase-9、caspase-3蛋白，最終激活凋亡途徑誘導細胞凋亡[6]。

1.2 中醫(yī)藥通過干預PI3K/Akt/mTOR信號通路促進細胞凋亡

鄭曉珂等[7]選取人胃癌細胞SGC-7901作為研究對象，將細胞分為對照組及3個濃度(50、100、200 μmol/L)黃芩苷組，結果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷組可呈劑量依賴性的抑制癌細胞活力，增加Bax表達、降低Cyclin D1、Cyclin A1及Bcl-2表達，抑制P13K、Akt磷酸化水平，將細胞周期被阻滯于G1期，表明黃芩苷能阻斷P13K/Akt通路激活及抑制下游分子的表達，從而抑制胃癌細胞SGC-7901的生長。楊靜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可通過抑制胃癌MFC細胞內(nèi)P13K、Akt、mTOR的蛋白水平表達，抑制其上下游蛋白信號的傳導，上調癌細胞內(nèi)BaX、下調Bcl-2蛋白表達水平，誘導G2/M期胃癌MFC細胞阻滯，從而導致癌細胞凋亡。李鳳等[9]研究證實，將50只雄性大鼠分為正常組、胃癌組及不同濃度天南星水提取物組檢測每組大鼠相關蛋白表達發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高濃度的天南星水提取物干預后胃癌大鼠增殖率顯著下降，大鼠癌細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表達被明顯調控，同時具有濃度依賴性下調PKM2、mTOR相對表達，說明天南星水提取物可通過調節(jié)Bcl-2、PI3K、Akt蛋白表達促進大鼠癌細胞組織凋亡，不僅如此，該研究還證實天南星水提取物也可提升大鼠中胃動素、胃泌素水平，使胃癌大鼠胃功能得以改善。賀文煜等[10]對胃癌細胞SGC-7901細胞研究發(fā)現(xiàn)，對癌細胞單純使用阿達帕尼會產(chǎn)生耐藥性，而應用高良姜素可降低線粒體膜電位凋亡途徑，且300mg/L高良姜與20mg/L阿帕替尼聯(lián)合應用是最佳干預濃度，能明顯上調p-p38蛋白表達，并抑制Bcl-2蛋白表達和誘導Bax表達，下調p-Akt的表達，從而抑制胃癌SGC-7901細胞凋亡。劉景華等[11]研究選用胃癌SGC-7901細胞發(fā)現(xiàn)，甘草次酸能通過上調Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平，下調Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平促使癌細胞停滯在G2/M期，阻滯細胞分裂進而引起細胞凋亡。劉俊等[12]研究采用濃度及作用時間不同的白藜蘆醇作用于胃癌SGC-7901細胞發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過抑制PI3K/Akt信號通路活性，上調Bax和Caspase-3、下調Bcl-2、p-Akt蛋白水平，且隨著時間及劑量的增加胃癌SGC-7901細胞存活率明顯降低。李偉等[13]研究采用不同濃度的姜黃素對胃癌細胞BGC-823和MKN-28研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能下調p-Akt、p-mTOR、Bcl-2的表達，上調癌細胞中Bax、caspase-3和caspase-9凋亡蛋白表達，且與劑量成依賴性。游莉等[14]研究采用低、中、高濃度的紅景天苷干預胃癌AGS細胞，CCK-8、Hoechst染色、流式細胞術和蛋白質免疫印跡法等多種檢測法得出，紅景天苷呈濃度依賴性地阻止胃癌AGS細胞增殖，使抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，上調Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9等促凋亡蛋白的表達，降低p-P13K及p-Akt活性，表明紅景天苷能顯著降低癌細胞增殖，且能干預PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導細胞凋亡；同樣，Rong等[15]研究也選用紅景天苷干預胃癌AGS細胞及相同的檢測法發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能顯著促進細胞核固縮，提高Bax/Bcl-2比值，上調caspase蛋白表達，下調PI3K和Akt磷酸化水平，這些結果表明紅景天苷主要通過線粒體途徑誘導胃癌細胞凋亡，此外研究還發(fā)現(xiàn)紅景天苷誘導的細胞凋亡在PI3K/Akt激動劑胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)干預后顯著受到抑制，更加證實紅景天苷可通過抑制PI3K/Akt通路促進胃癌細胞AGS凋亡。

當前，中醫(yī)藥調控PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導細胞凋亡已成為治療胃癌的新方法，研究主要多集中以調節(jié)Bcl-2家族蛋白、caspase為作用靶點進行研究，缺少對腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體超家族、p53等基因深入研究，PDCD4是當前研究領域新發(fā)現(xiàn)的與細胞周期及凋亡相關的調控因子[16], 其主要作用機制是通過蛋白轉錄及翻譯過程來實現(xiàn)抑制胃癌細胞的生長, 但中醫(yī)藥對PDCD4研究頗少，應進一步研究中醫(yī)藥對多種基因的干預以提高中醫(yī)診治的全面性。

2 誘導細胞自噬

2.1 細胞自噬與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系

自噬是吞噬細胞蛋白質或細胞器，將其包裹成自噬小泡，送入溶酶體融中進行降解，從而幫助細胞代謝在合成、降解中得以循環(huán)利用[17]，自噬在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其中LC3可作為細胞自噬過程中活性檢測的標志蛋白，可分為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型，LC3-Ⅰ本身無生理活性，當自噬啟動后LC3-Ⅰ會產(chǎn)生酶解作用，降解掉一部分多肽進而轉變成有活性的LC3-Ⅱ，由此 LC3-II/LC3-I 比值可以反映細胞自噬水平[18]，其相關蛋白Beclin-1、p62等同樣在早衰控制中發(fā)揮顯著作用。PI3K/Akt/mTOR信號通路在調控細胞自噬的過程中發(fā)揮著重要作用，其中抑制I型P13K中能阻止下游Akt及mTOR的活性激活，下游的mTOR 是一種自有效的自噬抑制劑，當被抑制后能激活下游靶基因ULK1活性，進而促使自噬相關基因Atg復合體的產(chǎn)生，增加自噬蛋白 LC3-II/LC3-I比值，使LC3-II通過自噬相關蛋白Atg3及Atg7的調節(jié)下轉移至細胞膜演變成自噬小體[19]。

2.2 中醫(yī)藥通過干預PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導細胞自噬

霍浩然等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的川芎嗪組作用于胃癌SGC-7901細胞后能顯著增加自噬溶酶體數(shù)量，通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路活性及下游相關蛋白表達，上調Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達，增加自噬蛋白 LC3-II/LC3-I比值，同時下調p-p13k、p-Akt、p-mTOR蛋白表達，從而促進胃癌SGC-7901細胞自噬。陳偉妍等[21]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能上調自噬相關蛋白ULK1、LC3B、促凋亡因子BAX的蛋白水平，下調抗凋亡因子Bcl-2、Ⅰ型PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平，從而誘導胃癌細胞MGC-803發(fā)生自噬起到抗腫瘤的作用。孫悅等[22]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芹菜素干預后的胃癌SGC-7901細胞能出現(xiàn)自噬囊泡及自噬溶酶體，且加入自噬抑制劑氯喹或3-甲基腺苷后芹菜素仍可上調自噬蛋白LC3-II和Beclin-1，并且通過內(nèi)質網(wǎng)應激途徑誘導細胞凋亡, 下調胃癌SGC-7901細胞中p-Akt及其下游p-m TOR蛋白表達；Kim等[23]人也選用芹菜素作用于胃癌ASG細胞后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芹菜素處理過的AGS癌細胞同樣出現(xiàn)了自噬囊泡，并且在內(nèi)質網(wǎng)應激途徑誘導下，上調自噬相關蛋白LC3-II、beclin-1及p62表達，表明芹菜素能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導癌細胞發(fā)生自噬。喬丹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，被黃芩素處理后的胃癌MGC-803細胞內(nèi)酸性溶解酶顯著增加，使自噬蛋白LC3蛋白水平上升，上調P62蛋白水平，下調P13K和Akt的磷酸化水平，表明黃芩素可干預PI3K/Akt信號通路從而誘導MGC-803細胞產(chǎn)生自噬。陳圣敏等[25]研究選取橘紅素作用于24小時、48小時的胃癌AGS細胞聯(lián)合自噬抑制劑氯喹干預后發(fā)現(xiàn)，橘紅素單獨應用于胃癌AGS細胞后可提升自噬蛋白LC3Ⅱ和p62的表達、降低p-Akt、p-mTOR的蛋白表達，且與氯喹聯(lián)合應用效果更加顯著，并與時間和劑量呈正相關，表明橘紅素能干預PI3K/Akt/mTOR信號通路從而抑制胃癌AGS細胞的自噬流，形成自噬體的堆積，誘導AGS細胞凋亡。但是ZHANG等[26]得出了相反的觀點，研究選用甘草根中提取出的異甘草素作用于MKN28胃癌細胞后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)異甘草素干預后的自噬蛋白p62表達反而下調，本文認為這可能與實驗的檢測方法不同有關。Raha等[27]從中藥骨碎補中提取出柚皮苷作用于胃癌AGS細胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)柚皮苷處理過的胃癌AGS細胞在核周附近形成了自噬囊泡，且用雷帕霉素預處理柚皮苷后，AGS細胞中mTOR磷酸化水平顯著降低，LC3B激活水平顯著升高，通過時間依賴性處理柚皮苷后觀察到mTOR磷酸化水平的降低與溶酶體功能激活有關。

上述研究均表明，中醫(yī)藥在干預PI3K/Akt/mTOR信號通路后LC3在胃癌組織中的表達呈正相關，亦有研究認為，LC3表達與腫瘤的增殖、轉移呈負相關且低表達時預后較差[28]，本文認為今后需要進行大量歸納總結以明確結果的可靠性。當前關于中藥單體在細胞自噬領域研究較深，但中藥單體大多脫離了臨床辨證的概念，這也是今后研究中需要考慮和改進的問題。

3 抗腫瘤血管生成

3.1 腫瘤血管生成與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系

腫瘤血管生成在癌細胞形成、增殖和轉移中處于根基作用，相關研究發(fā)現(xiàn)，在調節(jié)腫瘤血管生成過程中包含多類活性物質，其中有成纖維細胞生長因子(fibroblast growth fator， FGF) 、血管內(nèi)皮細胞生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF) 、血管生成素-2 ( angiopoietin- 2，Ang-2) 、環(huán)氧化酶( cyclooxygenase，COX)等[29]。VEGF是促進血管內(nèi)皮生長最有效的細胞因子，其上游基因缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor1, HIF-1α)在誘導新生血管生成中占據(jù)主要地位，VEGF啟動子包括HIF-1α結合位點，兩者共同結合調控腫瘤血管生成。P13K中亞基(p110)被激活后能誘導VEGF表達從而使細胞內(nèi)皮遷移[30]，且活化后的Akt及mTOR通路促進HIF-1α高表達和缺氧誘導因子的釋放，進而激活VEGF促進血管形成[31]。

3.2 中醫(yī)藥通過干預PI3K/Akt/mTOR信號通路調控腫瘤血管生成

劉寧寧等[32]研究分別設置MKN45細胞組、幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)感染MKN45細胞組以及不同濃度的健脾解毒方組，然后按比例配比的方式將上清液與細胞培養(yǎng)混合成條件培養(yǎng)液觀察健脾解毒方對血管新生的影響發(fā)現(xiàn)，Hp感染MKN45細胞上清液中的VEGF的蛋白明顯上調，對第十染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)及Akt蛋白的表達無變化，但是對p-PTEN和p-Akt蛋白表達有促進作用，同樣健脾解毒方作用于Hp感染的癌細胞MKN45上清液中VEGF的蛋白水平明顯下調，PTEN和Akt亦無影響，但可下調p-PTEN和p-Akt蛋白表達，且成劑量依賴性，說明健脾解毒方可通過調控抑制P13K/Akt/mTOR信號通路進而調節(jié)Hp感染的人胃癌VEGF表達。馮磊等[33]研究發(fā)現(xiàn)，三七皂甙R1作用于AML小鼠癌細胞后能降低p-Akt、p-mTOR磷酸化水平抑制P13K/Akt信號通路激活，且能正向調節(jié)凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，同時負向調節(jié)腫瘤血管VEGF表達。肖麟等[34]選取30只SD雄性大鼠造模后分成胃癌組、銀杏酮組及正常組，發(fā)現(xiàn)銀杏酮可干預p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平，同時在大鼠癌細胞中VEGF下調水平明顯優(yōu)于其他組。ZHANG等[35]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rd在缺氧情況下能抑制Akt/mTOR信號通路，呈劑量依賴性地抑制VEGF誘導下的人臍血管內(nèi)皮細胞增殖。宋卓等[36]研究通過檢測荷瘤小鼠腫瘤相關巨噬細胞介導下相關因子的表達水平得出相反觀點，即扶正解毒方聯(lián)合化療組可顯著調節(jié)P13K/Akt/mTOR信號通路中的下游因子p70S6K1，通過p70S6K1上調的HIF-1α喚起VEGF基因的轉錄，上調VEGF的表達，進而調控腫瘤血管生成并改善乏氧微環(huán)境，本文提出相反觀點可能與研究人員選取胃癌細胞的時期不同有關。

“活血解毒”是中醫(yī)藥介入PI3K/Akt/mTOR信號通路治療胃癌的主要方向之一，臨床上常用具有此類作用的單體及復方來調控腫瘤血管生成。VEGF在調控腫瘤血管中的作用顯著，但其表達及生成的調控機制尚未清晰，且大部分實驗數(shù)據(jù)來自動物和體外研究，因此臨床試驗更是鳳毛麟角，這應是未來研究領域所應關注的重點。

4 調節(jié)miRNA基因

4.1 miRNA基因與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，通過與mRNA的3'端非編碼區(qū) (3'-UTR) 結合, 促使mRNA降解而調節(jié)靶基因的表達，可在進化過程中保持高度保守，并通過不同的調控途徑影響細胞增殖和凋亡[37]，miRNA的異常表達在胃癌等腫瘤的進展中起著不可或缺的作用[38],且已有研究表明miRNA為潛在的胃癌生物標記物[39]。研究發(fā)現(xiàn)[40]，miR-21在胃癌組織中呈低表達，能誘導腫瘤細胞凋亡，其機制是通過抑制關鍵靶點PTEN，促進P13K和Akt磷酸化從而激活PI3K/Akt信號通路。KE等[41]研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a的上調能顯著抑制p-Akt、p-mTOR及細胞色素C表達水平，下調caspase-3的表達和Bax/Bcl-2的比率。

4.2 中醫(yī)藥通過干預miRNA調控PI3K/Akt/mTOR信號通路

馮旻璐等[42]研究發(fā)現(xiàn)，木瓜總三萜能降低細胞HGC-27線粒體活性及細胞增殖活力，降低p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達，且經(jīng)miR-10a mRNA干預的細胞HGC-27可產(chǎn)生類似的作用，其機制與促進miR-10a mRNA表達，抑制P13K/Akt/mTOR通路有關。陳澤慧等[43]將胃癌前病變的大鼠分為模型組、維酶素組和消痞顆粒組，采用實時熒光定量和酶聯(lián)免疫吸附法檢測相關基因(miR-21、PTEN)和蛋白表達發(fā)現(xiàn)，消痞顆粒組與其他兩組相比可明顯通過下調胃黏膜組織miR-21，解除對PTEN基因的抑制，恢復其基因活性，抑制PIP3信號傳導減少Akt活化從而干預P13K/Akt通路，有效逆轉胃癌前細胞的生成。YANG L等[44]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷顯著抑制癌SNU-216和MGC-803細胞中Bcl-2、p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平，上調Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的水平，而miR-99a抑制劑可消除紅景天苷對通路的調節(jié)作用，增強的miR-99a可以通過直接調節(jié)PI3K/Akt途徑的上游基因IGF1R的表達,從而產(chǎn)生IGF1R蛋白，在配體結合作用下調節(jié)miR-99a/IGF1R來抑制PI3K/Akt信號傳導，抑制細胞的生長和遷移。

miRNA在治療胃癌靶點中具有不可替代性，本文指出調節(jié)特定miRNA的表達來干預蛋白基因治療胃癌細胞，然而，靶基因的表達受許多不同miRNA的調控，研究顯示miR-28[45]、miR-592[46]、miR-582[47]、miR-361-5p[48]亦與P13K/Akt/mTOR信號通路密切相關，但當前中醫(yī)藥研究仍處于探索階段，今后應加強對相關靶點的調控治療胃癌。

5 展望

目前，現(xiàn)代醫(yī)學對于胃癌的治療以放化療、手術、生物靶向治療等綜合療法為主，治療尚無特效藥物，隨著近年來對胃癌的研究逐漸增加，已經(jīng)認識到P13K/Akt/mTOR信號通路與胃癌發(fā)生進展密切相關，中藥單體及有效成分、復方均證實通過P13K/Akt/mTOR信號通路在誘導細胞凋亡、細胞自噬，抗腫瘤血管生成，調節(jié)靶向基因方面有確切療效，且副作用相對較少。

現(xiàn)階段對胃癌的發(fā)病機制尚未完全闡明，中醫(yī)藥通過干預P13K/Akt/mTOR信號通路治療胃癌作用機制的研究仍需不斷深入，現(xiàn)存在一些不足：(1)本文論述了通過中醫(yī)藥干預PI3K/Akt/mTOR信號通路進而誘導細胞凋亡、細胞自噬調節(jié)機制在胃癌發(fā)展過程中的作用，同時筆者觀察近年來中醫(yī)藥在治療胃癌過程中的現(xiàn)狀研究，發(fā)現(xiàn)多集中在凋亡和調控單方面，缺少凋亡/自噬共同調控的優(yōu)勢；(2)在抗腫瘤血管生成方面，研究靶點多數(shù)集中在研究VEFG調節(jié)方面而對其他靶點的研究尚未深入，中醫(yī)藥多靶點共同干預的作用未能彰顯；(3)治療胃癌領域的中藥單體及復方大多數(shù)具有苦寒之性，考慮苦寒性味對胃癌P13K/Akt/mTOR信號通路的干預可能與藥性相關，那么其他性味是否也對此信號通路有所干預呢？(4)對于中藥單體及有有效成分研究較多，中藥復方、中成藥、中醫(yī)外治等與辨證論治觀念聯(lián)系密切的研究較少，這應是未來研究領域所應思考的點。