夏蘊(yùn)實(shí)，劉暢，王梓，孫印石*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所（長(zhǎng)春 130000）；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院（長(zhǎng)春 130000）；3. 長(zhǎng)春大學(xué)食品學(xué)院（長(zhǎng)春 130000）

我國(guó)是世界上梅花鹿養(yǎng)殖歷史最悠久的國(guó)家，是世界三大養(yǎng)鹿國(guó)（新西蘭、中國(guó)、俄羅斯）之一[1]。鹿油是鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nippon）或馬鹿（Cervus elaphus）的脂肪油，也叫鹿脂，是一種資源豐富的鹿副產(chǎn)品，具有較高的可利用價(jià)值。鹿油的提取方式主要有熬制法[2]、超臨界二氧化碳萃取法[3]和水酶法。熬制法因提取溫度較高且不易控制火候，容易出現(xiàn)焦糊，對(duì)鹿油中有效成分也有一定影響，影響油脂品質(zhì)；超臨界二氧化碳提取法工藝繁瑣且費(fèi)用較高，導(dǎo)致所提油脂價(jià)格昂貴。

水酶法的作用原理是采用相關(guān)的酶（如淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等）在水相中降解油料細(xì)胞壁、分解油料細(xì)胞與其他大分子形成的復(fù)合物，使油脂從油料中釋放出來(lái)，并利用油和水密度不同，通過(guò)離心將非油成分和油分離[5]，具有綠色環(huán)保、反應(yīng)條件溫和、安全等優(yōu)點(diǎn)[4]。近年來(lái)，水酶法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物油脂的提取中。吳詳庭[6]以水酶法提取鮐魚油，在酶量1 000 U/g原料，pH 7.3，45 ℃條件下提取率達(dá)78.66%，且以該法提取油脂可有效降低乳化，提高油脂提取率，操作方法簡(jiǎn)單高效，價(jià)格低廉，便于商業(yè)化生產(chǎn)。王慶玲等[7]首次利用水提法提取豬油并比較4種蛋白酶對(duì)提油率的影響，結(jié)果表明，堿性蛋白酶所提豬油提取率最高，可達(dá)96.82%。由于水酶法提取溫度較低，與傳統(tǒng)提油方法相比，所得豬油的基本理化指標(biāo)結(jié)果均優(yōu)。

有研究使用單一的木瓜蛋白酶提取鹿油，提取率較低，為73.7%±0.4%[8]。為有效提高鹿油提取率，試驗(yàn)以鹿板油為原料，采用復(fù)合酶水酶法提取鹿油，考察提取條件對(duì)鹿油提取率的影響，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取鹿油的工藝條件，利用GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）對(duì)鹿油的脂肪酸組成進(jìn)行分析與鑒定，為鹿油的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹿油（未經(jīng)加工的新鮮梅花鹿板油，長(zhǎng)春市世鹿鹿業(yè)有限公司）；中性蛋白酶（50 000 U/g，Solarbio）；堿性蛋白酶（200 000 U/g，Solarbio）；氫氧化鈉、甲醇、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈣（北京化工廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

ME2002/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；HH-4A型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；DZF-6090型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；7890A/7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水酶法提取鹿油

取200 g清洗、瀝干水分后的冷凍鹿板油，切碎成小塊，按料液比1∶1（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，加入一定量的酶，在一定溫度下緩慢攪拌一定時(shí)間，反應(yīng)完成后在90～95 ℃下水浴10 min滅酶活，在5 000 r/min條件下離心20 min，吸取上層油，真空干燥，得鹿油。做3組平行試驗(yàn)。

1.3.2 提取率計(jì)算

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在確定料液比基礎(chǔ)上，以鹿油提取率為指標(biāo)，分別以復(fù)合酶配比、酶解溫度、提取時(shí)間、pH和加酶量為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以鹿油提取率為指標(biāo)，選擇復(fù)合酶配比、酶解溫度、提取時(shí)間、pH和加酶量為考察因素，按L9(34)正交因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.5 理化指標(biāo)

水分測(cè)定按GB 5009.3—2016進(jìn)行測(cè)定；酸價(jià)按GB 5009.229—2016進(jìn)行測(cè)定；過(guò)氧化值按GB 5009.227—2016進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 脂肪酸組成分析

1.3.6.1 甲酯化處理

稱取150 mg鹿油，加入8 mL 2% NaOH-甲醇溶液，于80±1 ℃回流，直至油滴消失，冷卻至室溫，加入7 mL 15% BF3-甲醇溶液，于80±1 ℃回流3 min，取出，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入15 mL正庚烷，渦旋2 min，加飽和NaCl水溶液，靜置分層。吸取約5 mL上層正庚烷液至裝有3～5 g無(wú)水硫酸鈉的50 mL離心管中，渦旋1 min，離心，上清液稀釋10倍或100倍進(jìn)樣。

1.3.6.2 氣質(zhì)聯(lián)用儀條件

色譜柱，DB-23 60 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣，高純He；載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口220 ℃；EI源230 ℃。程序升溫條件：初始溫度60 ℃，保持1 min，10 ℃/min，升溫至180 ℃，以3 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用S P S S 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVE），Duncan法進(jìn)行多因子比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶配比對(duì)鹿油提取率的影響

在料液比1∶1（g/mL），酶解溫度50 ℃，加酶量1%，pH 7.0，酶解時(shí)間1 h條件下，研究復(fù)合酶配比對(duì)鹿油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。復(fù)合酶提取率均高于單一酶提取率，可能是由于復(fù)合酶使酶解更加完全。隨著酸性蛋白酶添加比例降低、堿性蛋白酶添加比例升高，鹿油提取率升高，中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶3時(shí)，鹿油提取率達(dá)到最高，為83.6%。進(jìn)一步升高堿性蛋白酶比例，提取率反而降低，可能是由于過(guò)度的堿性蛋白酶的添加阻礙了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。后續(xù)試驗(yàn)以復(fù)合酶配比（中性蛋白酶∶堿性蛋白酶）1∶3進(jìn)行。

圖1 復(fù)合酶配比（中性蛋白酶∶堿性蛋白酶）對(duì)鹿油提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)鹿油提取率的影響

在料液比1∶1（g/mL），加酶量1%，pH 7.0，酶解時(shí)間1 h，復(fù)合酶配比1∶3條件下，酶解溫度為35～60 ℃時(shí)，研究不同酶解溫度對(duì)鹿油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。溫度35～55 ℃時(shí)，隨著溫度升高，提取率逐漸升高；55 ℃時(shí)提取率最高，為85.6%；溫度超過(guò)55℃時(shí)，提取率逐漸下降。因此，55 ℃為復(fù)合酶解最適溫度，溫度升高和降低都會(huì)抑制復(fù)合酶活性，進(jìn)而影響鹿油提取率[9-10]。后續(xù)試驗(yàn)以酶解溫度55 ℃進(jìn)行。

圖2 酶解溫度對(duì)鹿油提取率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響

在料液比1∶1（g/mL），酶解溫度55 ℃，加酶量1%，pH 7.0，復(fù)合酶配比1∶3，酶解時(shí)間0.5～3.5 h條件下，研究不同酶解時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。酶解時(shí)間0.5～2.5 h時(shí)，鹿油提取率隨著酶解時(shí)間的增加而升高，酶解時(shí)間超過(guò)2.5 h時(shí)，鹿油提取率逐漸趨于平緩。其中，酶解時(shí)間1.0～2.5 h時(shí)，復(fù)合酶反應(yīng)速率較快，2.5 h后底物反應(yīng)近乎完全，且產(chǎn)物抑制等作用導(dǎo)致反應(yīng)速率降低[11-13]。因此最適提取時(shí)間為2.5 h，提取率為84.4%。后續(xù)試驗(yàn)以酶解時(shí)間2.5 h繼續(xù)進(jìn)行。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響

2.1.4 加酶量對(duì)鹿油提取率的影響

在料液比1∶1（g/mL），酶解溫度55 ℃，pH 7.0，酶解時(shí)間2.5 h，復(fù)合酶配比1∶3，加酶量0.5%～4%條件下，研究不同加酶量對(duì)鹿油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。加酶量＜2.0%時(shí)，隨著加酶量增加，鹿油提取率逐漸升高，加酶量2%時(shí)達(dá)到最高，為87.5%。加酶量＞2.0%時(shí)，鹿油提取率降低，原因可能是復(fù)合酶濃度超過(guò)一定量時(shí)，酶和底物不能充分接觸，導(dǎo)致酶促反應(yīng)效率下降[14]，因此后續(xù)試驗(yàn)以加酶量2%進(jìn)行。

圖4 復(fù)合酶添加量對(duì)鹿油提取率的影響

2.1.5 pH對(duì)鹿油提取率的影響

在料液比1∶1（g/mL），酶解溫度55 ℃，加酶量2%，酶解時(shí)間2.5 h，復(fù)合酶比1∶3，pH 4.5～8.0條件下，研究不同pH對(duì)鹿油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。pH＜ 7.0時(shí)，鹿油提取率隨著pH的升高而升高，pH＞7時(shí)，鹿油提取率隨著pH升高而降低；pH 7.0時(shí)，鹿油提取率達(dá)到最高，為78.8%。這可能與蛋白酶的底物適應(yīng)性有關(guān)[15]。因此，復(fù)合酶解最適pH為7.0。

圖5 pH對(duì)鹿油提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選取復(fù)合酶配比、酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間為自變量，以鹿油提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交因素水平

由表2中極差值R可知，4個(gè)影響因素對(duì)鹿油提取率影響程度大小依次是B＞D＞A＞C。所得最優(yōu)方案為B2D2A2C2，即酶解溫度55 ℃、pH 7.0、復(fù)合酶配比1∶3、加酶量2%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述最優(yōu)條件，完成3組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，所得提取率分別為84.3%，86.1%和85.7%，3組結(jié)果無(wú)顯著差異。由此可知，試驗(yàn)優(yōu)化的提取工藝具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.4 最佳條件下所提鹿油的理化指標(biāo)

由表3可知：最佳提取條件下所得鹿油含水量為6.25%，水酶法提取油脂中通常含有較多水分，高速離心并不能完全去除油脂中的水分，通常需要通過(guò)直接干燥法或減壓干燥法去除多余水分；最佳提取條件下所得鹿油的酸價(jià)為2.27 mg/g，低于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食用動(dòng)物油脂》所規(guī)定的酸價(jià)≤2.50；過(guò)氧化值為0.26 g/100 g，稍高于過(guò)氧化值≤0.20，可能是由于存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或存放過(guò)程中接觸到空氣、陽(yáng)光，使所提鹿油過(guò)氧化值略有升高[16]。

表3 鹿油的理化指標(biāo)

2.5 鹿油脂肪酸組成分析

采用GC-MS對(duì)甲酯化衍生的鹿油脂肪酸組成進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖見(jiàn)圖6。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)其脂肪酸進(jìn)行定性，并按峰面積歸一化法進(jìn)行定量，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

圖6 鹿油脂肪酸甲酯氣相色譜圖

由表4可知，通過(guò)外標(biāo)法在復(fù)合酶水酶法提取的鹿油中共檢測(cè)出20種脂肪酸。其中，含量大于5%的脂肪酸共5種，依次是棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1n9C）、棕櫚油酸（C16∶1n7）、亞油酸（C18∶2n6）。飽和脂肪酸9種，主要包括棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻酸等，占脂肪酸總量的64.60%；單不飽和脂肪酸4種，包括油酸、棕櫚油酸等，占脂肪酸總量的28.56%；多不飽和脂肪酸7種，包括亞油酸、亞麻酸等，占脂肪酸總量的6.62%。

表4 鹿油中脂肪酸組成及含量

棕櫚酸又稱軟脂酸，其鈉鹽是肥皂的主要成分之一，在工業(yè)上通常由動(dòng)植物油脂皂化制得，且被廣泛應(yīng)用于潤(rùn)滑劑、涂料、油墨和增塑劑中。硬脂酸主要用于生產(chǎn)硬脂酸鹽，在食品工業(yè)、化妝品工業(yè)及橡膠工業(yè)均有廣泛應(yīng)用[17]。油酸、棕櫚油酸、亞油酸是不飽和脂肪酸，能夠降低血液黏稠度、改善血液微循環(huán)、保持細(xì)胞膜的相對(duì)流動(dòng)性，以保證細(xì)胞的正常生理功能，部分不飽和脂肪酸還具有免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)血脂等作用，如亞油酸[18-20]。

3 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化復(fù)合蛋白酶水酶法提取鹿油的工藝，各因素對(duì)鹿油提取率影響的大小依次為B＞D＞A＞C，所得最佳工藝參數(shù)：料液比1∶1（g/mL），酶解溫度55 ℃、pH 7.0、復(fù)合酶配比1∶3、加酶量2%。在此條件下，鹿油提取率為85.37%。采用GC-MS對(duì)復(fù)合酶水酶法提取的鹿油成分進(jìn)行分析鑒定，共鑒定出20種化合物，主要含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、棕櫚油酸、亞油酸等，其中不飽和脂肪酸占64.60%，單不飽和脂肪酸占28.56%，多不飽和脂肪酸占6.62%。水酶法是一種簡(jiǎn)單、溫和且無(wú)污染的提取油脂方法，復(fù)合酶提取鹿油較單一酶提取更為完全，明顯提高鹿油提取率，具有潛在應(yīng)用前景。