陳小燕， 宋 琳， 朱蕾靜， 黃卓敏， 安雅睿*

（上海理工大學 理學院，上海 200093）

人免疫球蛋白G（HIgG）作為人血清中含量最高的免疫球蛋白，可作為靶標抗原被用于各種慢性感染、慢性肝病、肝癌、淋巴瘤和某些自身免疫性疾病比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、分泌型多發(fā)性骨髓瘤以及免疫缺陷病的監(jiān)測與診斷[1]。因此，探索可用于HIgG靈敏檢測的分析方法在多種疾病的臨床研究中具有重要意義。目前常見的檢測HIgG的方法有熒光法、放射免疫測定法和酶聯(lián)免疫吸附測定法，但這些方法成本昂貴，操作復雜，難以實現(xiàn)高效準確測定HIgG。電化學免疫傳感法是近幾年來興起的一種檢測方法，由于其操作簡便、成本低廉、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性較好等優(yōu)點，在人免疫球蛋白檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[2-3]。張潔課題組利用Bi2MoO6材料制備了一種超靈敏的電化學免疫傳感器用于檢測HIgG，檢測限低至4 pg/mL[4]，Thitirat Putnin等人設(shè)計了一種無標記的電化學免疫傳感器，其具有較高的靈敏度，線性范圍為1.0～50 ng/mL[5]。

受現(xiàn)有技術(shù)啟發(fā)，本文利用溶膠-凝膠的方法合成出二氧化鋯納米微粒（ZrO2NPs），并通過表面修飾氨基官能團的方法使ZrO2NPs可被用于固定人免疫球蛋白抗體。并利用具有良好導電性的多壁碳納米管與金納米微粒構(gòu)成的納米復合材料作為基底修飾電極表面，以期制得的免疫傳感器具有低檢測限、寬線性檢測范圍、高穩(wěn)定性、高選擇性的優(yōu)良性能。

1 實驗

1.1 試劑

人IgG、山羊抗人IgG購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）購于Sigma-Aldrich，氧氯化鋯八水（ZrOCl2?8H2O）、氯金酸（HAuCl4）、氨水、牛血清白蛋白（BSA）、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀三水、殼聚糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉購于國藥集團化學試劑有限公司，多壁碳納米管購于中國科學院成都有機化學有限公司。

1.2 儀器

電化學工作站（上海辰華儀器公司的CHI660E），數(shù)控加熱攪拌器（德國WIGGENS公司的WH220 PLUS），電阻爐（上海意豐電爐有限公司的YFX9/130-YC）。

1.3 合成并氨基功能化ZrO2NPs

ZrO2NPs的合成工作具體步驟如下[6]。將濃度為0.03 M的ZrOCl2溶液在攪拌下水解2 h，然后向溶液中逐滴加入氨水直至溶液pH變?yōu)?.0，此時，溶液變渾濁并產(chǎn)生白色凝膠。隨后，得到的凝膠以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心6 min并用去離子水沖洗，重復4次，離心清洗后的凝膠放入鼓風干燥箱200℃干燥過夜。然后，將干燥后的固體研磨并放入馬弗爐450℃煅燒6 h，最終得到純的ZrO2NPs。

ZrO2NPs的氨基功能化具體實驗步驟如下[7]。將20 mg制備好的ZrO2NPs加入4 mL異丙醇超聲分散后，加入40 μL 98%的APTES并在室溫下（25℃）以350 r/min攪拌48 h。將得到的懸濁液離心分離并以去離子水徹底沖洗后，得到的白色固體（氨基功能化的ZrO2NPs，APTES@ZrO2NPs）置于60℃干燥12 h。

1.4 合成金納米微粒-殼聚糖-多壁碳納米管納米復合材料

金納米微粒-殼聚糖-多壁碳納米管（AuNPs-CHIT-MWCNTs）納米復合材料的合成過程如下[8]。用將殼聚糖粉末溶解在體積分數(shù)為1.0%的醋酸溶液中并在室溫下緩慢攪拌1 h至完全溶解，得到0.5%（wt）殼聚糖溶液。隨后，在制得的殼聚糖溶液中加入0.5 mL 1 mM氯金酸溶液并在室溫下劇烈攪拌30 min。將該混合液在攪拌下放置于80℃反應(yīng)1 h，得到AuNPs-CHIT溶液。最后，將0.5 mg MWCNTs加入1 mL AuNPs-CHIT溶液并超聲2 h獲得一個均勻且穩(wěn)定的懸濁液，即AuNPs-CHIT-MWCNTs納米復合材料分散液。

1.5 免疫傳感器的制備

在進行電極修飾前，依次以粒徑為1.0、0.3和0.05 μm的氧化鋁粉末拋光處理玻碳電極（GCE，直徑3 mm）[9]。首先將4 μL AuNPs-CHIT-MWCNTs滴涂在電極表面并室溫干燥1 h，然后將5 μL APTES@ZrO2NPs溶液滴涂在電極表面并室溫干燥1 h，最后在室溫下（25℃）將電極浸泡在EDC/NHS活化的山羊抗人IgG溶液中4 h后，取出電極并用去離子水沖洗電極表面后，將電極以BSA溶液（1%，w/V）封閉30 min防止發(fā)生非特異性吸附。將制備好的電化學免疫傳感器（BSA/Ab/ZrO2NPs/AuNPs-CHIT-MWCNTs/GCE）儲存在4℃保存?zhèn)溆?。圖1描述了電化學免疫傳感器的構(gòu)建原理。

圖1 電化學免疫傳感器的構(gòu)建原理圖[9]

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs-CHIT-MWCNTs納米復合材料的表征

多壁碳納米管（MWCNTs）、金納米微粒（AuNPs）及金納米微粒-殼聚糖-多壁碳納米管（AuNPs-CHIT-MWCNTs）納米復合材料的形貌由掃描電子顯微鏡（SEM）和場發(fā)射透射電子顯微鏡（FETEM）表征且結(jié)果如圖2所示。由圖2a可知，MWCNTs的管徑大約20 nm，且從插圖可觀察到其明顯的多層管壁和中空管腔結(jié)構(gòu)。AuNPs具有較規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)且粒徑分布均勻，平均粒徑約為20 nm（圖2b）。將MWCNTs與AuNPs-CHIT均勻混合并超聲分散后，可觀察到大量AuNPs均勻地附著在MWCNTs的外管壁上形成一種納米復合材料（圖2c），這種復合結(jié)構(gòu)的存在使得該納米復合材料具有極好的導電性，從而可實現(xiàn)免疫傳感器靈敏度的大幅提高。

圖2 FETEM圖：（a）MWCNTs；（b）AuNPs；（c）AuNPs-CHIT-MWCNTs的SEM圖

2.2 ZrO2NPs的表征

通過ZrO2NPs的EDS能譜圖（圖3a），證實了納米微粒中只存在鋯、氧元素，而不含其它元素。從合成的ZrO2NPs的XRD測試結(jié)果（圖3b）可以觀察到，由于納米晶相具有較小的晶體尺寸，導致XRD圖中出現(xiàn)寬的衍射峰[10]。位于28.17°、31.47°、34.16°、40.72°、49.27°和50.12°的衍射峰與單斜晶型ZrO2（JCPDS 37-1484）的(ī11)、(111)、(200)、(ī12)、(220)、(022)晶面一一對應(yīng)，表明了單斜晶型的ZrO2NPs被成功合成[7]。利用衍射峰最強峰11)的半高寬，通過Scherer公式[10]計算得到晶體的平均粒徑大約為12 nm，這與通過透射電子顯微鏡觀察到的微粒尺寸基本相符。

圖3 ZrO2NPs的EDS圖（a），XRD圖（b）

如圖4所示，ZrO2NPs 和 APTES@ZrO2NPs的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）被用于表征氨基功能化前后粒子表面化學鍵的變化。兩個樣品光譜圖中的540 cm-1處都出現(xiàn)了對應(yīng)Zr-O對稱伸縮振動的特征吸收帶，而且，由于納米微粒表面含有羥基和吸附的水分子，兩個樣品在大約3430 cm-1的位置都顯示了一個寬的吸收帶[11]。在APTES@ZrO2NPs的譜圖中，出現(xiàn)在950 cm-1和1250 cm-1位置的吸收帶分別對應(yīng)于Si-O-Zr和Si-O-C的伸縮振動[7]。此外，位于1566 cm-1處的吸收帶是由APTES分子中氨基的剪式振動產(chǎn)生的，盡管由于與羥基的伸縮振動重疊而無法在3296 cm-1處顯示出吸收帶，但是在3366 cm-1位置出現(xiàn)的吸收帶仍屬于N-H的對稱伸縮振動[1,7]。所有這些新增的吸收帶和一個在2800～3000 cm-1的吸收帶都表明了APTES分子已經(jīng)被成功固定在ZrO2NPs表面，因此成功形成了氨基功能化的納米微粒[1]。

圖4 ZrO2NPs和APTES@ZrO2NPs的FT-IR圖

2.3 免疫傳感器的電化學表征

在含有5.0 mM [Fe(CN)6]3-/4-和0.1 M KCl的0.01 M PBS溶液（pH＝7.0）中進行循環(huán)伏安（CV）測試，可實現(xiàn)電極表面逐步修飾過程的監(jiān)測。如圖5所示，裸GCE（曲線a）在電極表面修飾了AuNPs-CHIT-MWCNTs納米復合材料得到AuNPs-CHIT-MWCNTs/GCE（曲線b）后，得到了相比于裸GCE更大的電流響應(yīng)。當ZrO2NPs被滴涂在修飾電極表面后，由于弱導電性的ZrO2NPs阻礙了電子轉(zhuǎn)移，使得電極的峰電流明顯降低（曲線c）。當人IgG抗體（曲線d）、BSA（曲線e）、人IgG進行孵育反應(yīng)（曲線f）后，修飾電極的峰電流因為蛋白質(zhì)會在一定程度上阻礙電子的轉(zhuǎn)移而逐漸降低。這些結(jié)果表明電極的逐步修飾過程被成功實現(xiàn)。

圖5 電化學免疫傳感器修飾過程的CV表征圖

2.4 免疫傳感器對人IgG的電化學測定

在最優(yōu)實驗條件下，利用DPV測定一系列不同濃度的人IgG溶液，實現(xiàn)了對構(gòu)建的免疫傳感器分析性能的評價。如圖6a所示，免疫傳感器的峰電流響應(yīng)隨著人IgG溶液濃度的增加而降低，且從圖6b可以看出，電流峰值與人IgG濃度的對數(shù)值在0.01～800.0 ng/mL 和800.0～6 000.0 ng/mL范圍內(nèi)分別具有線性關(guān)系，線性校正曲線的擬合方程分別為Ip＝－4.856 36 logc(ng/mL)＋108.61210（R2＝0.999 4）和Ip＝－23.457 99 logc(ng/mL)＋161.632 95（R2＝0.997 4），得到檢測限為3.0 pg/mL（S/N＝3）。之所以能實現(xiàn)如此低的檢測限和寬的線性檢測范圍，歸結(jié)于以下兩個因素：1）AuNPs-CHIT-MWCNTs納米復合材料極好的導電性促進了電子轉(zhuǎn)移；2）ZrO2NPs的多孔結(jié)構(gòu)和良好生物相容性有利于固定更多的抗體。

圖6 電化學免疫傳感器檢測0.01、0.1、1、10、50、100、200、400、800、1000、1500、 2000、2500、4000、5000、6000 ng/mL人IgG的（a）DPV電流響應(yīng)（曲線a～p）； （b）DPV電流峰值與對應(yīng)濃度對數(shù)值的線性校正曲線

2.5 選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了探究制備的免疫傳感器的選擇性，利用幾種潛在干擾物包括抗壞血酸（AA）、葡萄糖（Glu）、尿酸（UA）和BSA在最優(yōu)實驗條件下評估選擇性。可以看出含有目標物質(zhì)的待測物具有明顯的電流下降，說明該免疫傳感器具有令人滿意的選擇性（圖7a）。

檢測的重現(xiàn)性是衡量傳感器性能的一個重要指標。利用在相同的實驗條件下制得的五根修飾電極進行平行實驗，五次檢測結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為4.8%，表明該電化學免疫傳感器具有較好的重現(xiàn)性。針對穩(wěn)定性的研究工作是通過將制備好的電化學免疫傳感器置于PBS溶液（pH＝7.0）上方并保存在4℃的冰箱中，每隔五天將其取出檢測50 ng/mL人IgG，30天后，測得的電流大小與初始值相比差別不大（圖7b），實驗結(jié)果表明制備的免疫傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 電化學免疫傳感器（a）對AA，Glu，UA，BSA，IgG的選擇性； （b）4℃保存0、5、10、15、20、25、30天后的DPV電流峰值對比圖

3 結(jié)論

本工作中，二氧化鋯納米微粒、金納米微粒、殼聚糖和多壁碳納米管的納米復合材料被用于制備一種簡單靈敏的免標記人IgG電化學免疫傳感器。該傳感器表現(xiàn)出針對人IgG檢測的優(yōu)異性能，在最佳檢測條件下，對人IgG的線性檢測范圍為0.01～800.0 ng/mL、800.0～6 000.0 ng/mL，檢測限為3.0 pg/mL，具有較好的檢測優(yōu)勢，該免疫傳感器還具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，具備一定的實際應(yīng)用潛力。另外，基于該免疫傳感器簡單的構(gòu)造和良好的檢測性能，可通過替換相應(yīng)的抗體實現(xiàn)針對其它蛋白質(zhì)抗原的檢測。