黃冠，曹慧，符海鑫，張娜

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

0 引言

14-3-3蛋白作為一類適配蛋白，因其參與許多重要的細胞過程而在細胞生物學中占據(jù)重要地位[1]。越來越多的證據(jù)表明，14-3-3蛋白家族大多處于信號轉(zhuǎn)導的樞紐，在細胞運轉(zhuǎn)過程中扮演調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信息交換的重要角色[2]。14-3-3蛋白家族在哺乳動物中共有7種亞型[3]，在進化過程中極為保守[4]，主要分布在神經(jīng)組織中[5]，約占腦內(nèi)總蛋白含量3%，占可溶性總蛋白含量1%[6]。14-3-3蛋白參與許多細胞內(nèi)重要的生命活動和發(fā)生過程，涉及細胞周期檢驗點調(diào)控、離子通道功能和定位、細胞轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、腫瘤發(fā)育等諸多生理病理過程[7]。eIF2α激酶是一個由7種特征明確的絲氨酸-蘇氨酸激酶組成的家族，即

PERK（PKR-like ER kinase）、PKR（protein kinase double-stranded RNA-dependent）、GCN 2（general control non-derepressible-2）和HRI（heme-regulated inhibitor）。它們在應對感染、蛋白毒性和低水平必需營養(yǎng)物（如氨基酸和血紅素）時發(fā)揮重要且通常是必需的功能[8]。eIF2α的磷酸化通過降低蛋白質(zhì)合成的總體速率來保護細胞，并使細胞的翻譯起始機制偏向于在應激反應中起作用基因的mRNA的翻譯[9-10]。由于這些原因，eIF2α磷酸化及隨后的信號傳導途徑被稱為“綜合應激反應（ISR，integrated stress response）”[10]。在泌乳生物學中，泌乳期奶牛乳腺會不間斷地大量合成蛋白質(zhì)以供給細胞正常運行和乳汁的形成，由此產(chǎn)生大量的錯誤折疊蛋白反應在乳腺上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累而激活PERK引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，通過eIF2α的磷酸化，PERK阻止了新多肽的合成，從而減少了新生多肽進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的過程[11]。14-3-3β參與奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和調(diào)控泌乳的詳細分子機制尚不清楚。本實驗旨在驗證14-3-3β抑制對乳腺上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)鍵因子eIF2α和ATF4以及對泌乳效應的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

DM EM/F12培養(yǎng)基粉末、I型膠原酶，美國Gibco公司；Lipofectamine?2000 Reagent，美國Invitrogen公司；胎牛血清，以色列BI公司；脫脂乳粉，美國BD公司；14-3-3β抗體，美國BOSTER公司；p-eIF2α一抗、BCA蛋白濃度試劑盒、MTT細胞增殖檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-酪蛋白抗體，美國SANTA公司；β-actin抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ATF4抗體，美國BOSTER公司；HRP辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光檢測試劑，北京蘭杰柯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細胞培養(yǎng)箱，中國香港力康發(fā)展有限公司；生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；QuantStudio實時熒光定量PCR系統(tǒng)，美國Invitrogen公司；Tanon5200全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和純化

采用膠原酶消化法從泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺中分離并培養(yǎng)原代的乳腺上皮細胞。用15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）以及Dulbecco’s modified Eagle’s medium-F12?培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞并進行純化。純化后的奶牛乳腺上皮細胞，觀察上皮細胞形態(tài)和免疫熒光檢測奶牛乳腺上皮細胞生物標志物CK18的表達。

1.3.2 Western Blot

提取3個時期乳腺組織的蛋白樣品，BCA蛋白濃度試劑盒測定所提取蛋白樣品的濃度。采用Western Blot檢測各個時期的目標蛋白表達水平，總蛋白裂解液在10%的SDS-PAGE電泳中分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上。用5%脫脂乳封閉載有蛋白的NC膜，37℃封閉2 h。4℃環(huán)境下使用一抗過夜孵育NC膜?？贵w如下：14-3-3β，p-eIF2α（Ser51），β-casein，β-actin，ATF4。徹底漂洗NC膜，并使用HRP標記的二抗在37°C條件下孵育1 h。ECL發(fā)光檢測試劑檢測目的蛋白條帶，并采用ImageJ?進行灰度分析。

1.3.3 RNA干擾實驗

轉(zhuǎn)染siRNA于奶牛乳腺細胞中來敲除14-3-3β基因表達。正常培養(yǎng)的乳腺上皮細胞達到70%～80%融合率，20μmol/L siRNA或陰性對照oligo（NC）用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染細胞24 h后收集各組細胞樣品，用qRT-PCR確定最高干擾效率的siRNA。3個針對14-3-3βmRNA不同區(qū)域的siRNA，其中干擾效率最高的14-3-3βsiRNA序列如下：

1.3.4 實時熒光定量PCR

Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄進行cDNA的合成。反應體系為20μL，并用兩步法進行實時熒光定量PCR。

1.3.5 甘油三酯檢測

甘油三酯試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.6 MTT法檢測細胞增殖

向96孔板每孔中接種大約1 000個細胞，細胞培養(yǎng)過夜并且恢復到正常狀態(tài)后，進行轉(zhuǎn)染以及加藥處理。后按照MTT細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本實驗收集的所有數(shù)據(jù)均來自3個獨立實驗，以平均數(shù)±標準誤差表示。采用R Language（version 4.0.2）進行統(tǒng)計學的顯著性檢驗。One Way ANOVA對組間均值進行統(tǒng)計學比較，Tukey’s post-hoc-test分析各組平均值之間的差異?！?”表示P＜0.05，差異顯著；“**”表示P＜0.01，差異極顯著。P＜0.05或P＜0.01均被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育時期的奶牛乳腺14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表達水平差異檢測

采用qRT-PCR檢測青春期、泌乳期和退化期奶牛乳腺14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表達水平。結(jié)果如圖1所示，14-3-3β在青春期和退化期的mRNA表達水平基本一致，在泌乳期的表達水平最低；eIF2α在青春期和退化期的mRNA表達水平無明顯差異，在泌乳期的表達水平最低；ATF4在青春期的mRNA表達水平最高，而在泌乳期和退化期的表達水平無顯著差異。

圖1 不同發(fā)育時期14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表達水平

2.2 不同發(fā)育時期的奶牛乳腺14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表達水平差異檢測

采用Western Blot檢測青春期、泌乳期和退化期奶牛乳腺14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表達水平。結(jié)果如圖2所示，14-3-3β在退化期的蛋白表達水平最高，在泌乳期的表達水平最低；p-eIF2α在青春期和退化期的蛋白表達水平基本一致，在泌乳期的表達水平最高。ATF4在青春期的蛋白表達水平最高，在退化期的表達水平最低。

圖2 不同發(fā)育時期14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表達水平

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時14-3-3β抑制對ER應激相關(guān)基因的mRNA表達水平的影響

14-3-3β-siRNA轉(zhuǎn)染到奶牛乳腺上皮細胞正常培養(yǎng)24 h，如圖3所示，qRT-PCR分析表明14-3-3β的mRNA表達水平明顯下降。添加TG（1 umol/L）于正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除后的奶牛乳腺上皮細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果如圖4所示，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細胞中eIF2α、ATF4、CHOP和Caspase-3的mRNA都有明顯的提高。在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細胞中，eIF2α和ATF4的mRNA表達水平進一步明顯增加，同時CHOP和Caspase-3的mRNA表達水平顯示為指數(shù)級激增。

圖3 RNAi處理24 h的14-3-3β的mRNA表達水平

圖4 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后細胞應激相關(guān)基因的mRNA表達水平

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時14-3-3β抑制對酪蛋白的m RNA和蛋白表達水平的影響

14-3-3β-siRNA轉(zhuǎn)染到奶牛乳腺上皮細胞正常培養(yǎng)24 h，添加TG（1 umol/L）于正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除后的奶牛乳腺上皮細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果如圖5～6所示，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細胞中β-casein的mRNA和蛋白表達水平都有明顯下調(diào)，在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細胞中，β-casein的mRNA和蛋白表達水平進一步降低。

圖5 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后細胞相關(guān)的mRNA表達水平

圖6 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后β-酪蛋白的蛋白表達水平

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時14-3-3β抑制對BMECs乳脂的影響

如圖7所示，甘油三酯檢測結(jié)果表明，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細胞中甘油三酯的含量有明顯下降，在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細胞中，甘油三酯的含量進一步降低。

圖7 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后甘油三酯含量的變化

2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時14-3-3β抑制對BMECs細胞增殖的影響

如圖8所示，MTT法檢測結(jié)果表明，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細胞增殖率顯著降低，在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細胞中，細胞增殖率進一步降低。

圖8 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后的細胞增殖狀態(tài)

3 討論

14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)各種結(jié)合分子的功能，已成為許多重要細胞過程如信號轉(zhuǎn)導蛋白合成、蛋白折疊和降解、細胞周期、細胞骨架重排、細胞運輸、DNA復制、凋亡和生存等關(guān)鍵調(diào)控的組分[12]。以往的研究中，14-3-3家族的其他成員如14-3-3γ，與奶牛泌乳調(diào)控和細胞增殖中正向調(diào)控效應相關(guān)聯(lián)[13-15]，14-3-3ζ與神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能有關(guān)，14-3-3ζ的下調(diào)引起ER應激并增加對興奮性毒性損傷的脆弱性[16]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)泌乳期的奶牛乳腺組織14-3-3β和p-eIF2α呈顯著的負相關(guān)，提示泌乳期14-3-3β與應激有關(guān)的翻譯起始因子2α可能有某種關(guān)聯(lián)。泌乳期的奶牛需要合成大量的蛋白質(zhì)，mRNA的翻譯過程的動態(tài)平衡是保證細胞正常合成蛋白必需的。翻譯起始是整個蛋白質(zhì)合成過程的限速步驟，而eIF2α是翻譯起始的重要蛋白[17]。細胞為存活而出現(xiàn)了一種高度保守的應激誘導途徑—綜合應激反應[18]，當外部環(huán)境條件對細胞適應性有害時，ISR通過停止整體翻譯來維持細胞穩(wěn)定。ISR能夠感知獨特的應激源并磷酸化eIF2α，從而減弱m RNA 5’端帽狀結(jié)構(gòu)依賴的翻譯[19]。以ER應激為實驗背景，奶牛乳腺上皮細胞在14-3-3β敲除后對TG誘導的ER應激反應更為敏感，表現(xiàn)為eIF2α和ATF4的mRNA激增，而CHOP和Caspase-3的mRNA迅速增加與先前的14-3-3β敲除研究結(jié)果一致[20]。在TG的作用下，14-3-3β基因敲除誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的形態(tài)學改變，并進一步促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+外流[21]。14-3-3β蛋白作為接頭蛋白和伴侶的活性在上述條件下可能起重要作用。當敲除14-3-3β基因時，細胞中eIF2α磷酸化水平進一步升高，ER應激持續(xù)存在，導致蛋白質(zhì)翻譯持續(xù)關(guān)閉，eIF2α下游的ATF4激活不同的轉(zhuǎn)錄程序，以恢復內(nèi)在平衡重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[22-23]，或者在慢性壓力下，協(xié)同CHOP來激活Caspase家族并誘導細胞凋亡[24]。而eIF2α磷酸化狀態(tài)的持續(xù)時間和水平以及平行時間里激活的其他信號通路將決定eIF2α的磷酸化最終是促進死亡還是促進生存[25-26]。乳蛋白分泌特性的高低是衡量乳品質(zhì)優(yōu)良的標準，實驗顯示出在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下，14-3-3β敲除進一步下調(diào)了β-酪蛋白的mRNA和蛋白雙重水平的表達，并減少了乳脂的分泌，同時減緩了細胞增殖，提示14-3-3β能夠正向調(diào)控泌乳效應，對于維持細胞增殖狀態(tài)，乳蛋白和乳脂的表達是有必要的。

綜上所述，14-3-3β能夠正向調(diào)控泌乳，并參與ER應激關(guān)鍵因子eIF2α和ATF4的調(diào)控。找到精準改良乳品質(zhì)的方法是必要的，不可否認14-3-3蛋白作為候選靶標具有廣闊的前景，然而這一過程有關(guān)的分子機制還有待深入研究。