曹玉萍 王 倩 孟劍霞 程宏偉

（1 宿州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 宿州 234000；2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011；3 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，合肥 230022）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中的一種常見類型，具有較高的發(fā)病率、致殘率和死亡率[1-2]。腦出血發(fā)生后會引發(fā)腦水腫，神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，以及細(xì)胞死亡和凋亡等繼發(fā)性的神經(jīng)功能損傷[3-4]。腦出血會增加反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，進而產(chǎn)生膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。有研究表明GFAP 能通過抑制軸突再生，抑制神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的增殖和分化；還能減少谷氨酸鹽，讓腦組織重建時促進血管再生，進而對腦組織進行保護，恢復(fù)腦組織的神經(jīng)功能[5]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用，可維持成年腦組織的正常功能[6]。多巴胺是一種內(nèi)源性兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有重要的作用，因其具有調(diào)節(jié)運動的作用被廣泛認(rèn)知[7]。有研究顯示，精神障礙疾病會導(dǎo)致多巴胺功能失調(diào)，介導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病[8-9]。研究顯示[10]，多巴胺和白介素等單克隆抗體可保護損傷后的腦組織，但其具體的作用機制尚不清楚。本研究對出血性腦卒中大鼠給予多巴胺進行干預(yù)治療，觀察其對出血性腦卒中大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 的表達，并分析其對腦組織的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所有大鼠均來自北京化阜康生物科技股份有限公司，共計60 只健康大鼠，所有大鼠體質(zhì)量均為（300±20）g，正常飼養(yǎng)大鼠，保證實驗室清潔，晝夜交換更替，保持實驗室溫度在24℃。

1.2 試劑和儀器

鹽酸多巴胺注射液（上海禾豐制藥有限公司）；GFAP 抗體（北京中杉生物試劑公司）；BDNF 抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；TUNEL 染色液（Boehringer Mannheim 公司）。

1.3 動物分組與模型建立

將大鼠分為3 組，即假手術(shù)組（sham 組），大鼠腦出血模型組（ICH 組），大鼠腦出血模型給予多巴胺治療組（DA 組），每組20 只。本研究采用Fredrik[11]的方法制備大鼠腦出血模型，ICH 組和DA 組大鼠分別于右側(cè)腦組織基底核內(nèi)注入大鼠新鮮的自體不凝血。腹腔麻醉大鼠后，取出大鼠右側(cè)股動脈血，以備顱內(nèi)注射用。取動脈血后固定大鼠，將大鼠腦切開，暴露前鹵；將微量注射器的針端固定于前鹵前0.2 mm 處，以及中線右側(cè)旁開3 mm 處，在此處鉆出直徑為3 mm 的小孔。注射器從孔內(nèi)進針6 mm，進針處約為大鼠基底核的位置；將大鼠自體的50 μL 的動脈血5 min 內(nèi)完全注入，15 min后再將注射針慢慢拔出。將顱骨開的小孔用骨蠟進行封閉，把大鼠皮膚完全縫合后消毒。假手術(shù)組大鼠除不進行腦內(nèi)自體血注射外，其他的步驟與ICH組和DA 組大鼠相同。大鼠腦出血模型標(biāo)準(zhǔn)：可見大鼠腦組織切片中有明顯的水腫，并且腦室內(nèi)沒有血腫破入。

DA 組大鼠腹腔注射多巴胺溶液干預(yù)治療，20 mg/kg；假手術(shù)組和ICH 組大鼠均腹腔注射等量的生理鹽水干預(yù)，3 組大鼠均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.4 標(biāo)本采集

將大鼠麻醉，斷頭處死，取出腦組織，并分離腦組織中血腫的部位，放置于-20℃冰箱中冷藏備用。在制備模型過程中，沒有大鼠死亡，全部用于實驗。

1.5 神經(jīng)功能障礙評分

給藥后48 h，按照Garcia[12]方法對3 組大鼠的神經(jīng)功能障礙進行評分，其中自主活動、活動對稱性和前肢對稱性為0～3 分；觸摸觸須反應(yīng)、金屬絲鼠籠攀援和觸摸雙側(cè)軀干反應(yīng)為1～3 分。累計大鼠最后的得分，分?jǐn)?shù)越低代表神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.6 神經(jīng)元形態(tài)比較[13]

神經(jīng)功能測定后麻醉大鼠，并處死，將去除的腦組織固定于多聚甲醛溶液中，石蠟包埋并切成5 μm 的切片，尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài)，將切片放進入A 液中56℃染色60 min，PBS 漂洗，置于B 液分色數(shù)秒至2 min 直至背景色接近無色，自然晾干切片組織，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察尼氏小體數(shù)量。

1.7 腦水腫的測定

單獨一批大鼠用于腦水腫的測試。麻醉每組部分大鼠，PBS 溶液從左心室開始灌注，直至留出的液體呈透明時停止灌注。取出血腫周邊100 mg 的腦組織，并為腦組織進行稱量，稱其為濕質(zhì)量（W）；將大鼠的腦組織放在烤箱中烘干處理，對烘干后的質(zhì)量進行稱量，稱其為干質(zhì)量（D）。對腦組織的含水量進行計算，（W-D）/W，最后再乘以百分之百。

1.8 腦組織病理學(xué)形態(tài)觀察

分別將3 組大鼠的腦組織取出，固定后進行石蠟包埋、切片，每個切片均為5 μm，切片脫蠟后行H-E 染色。觀察腦組織形態(tài)的變化。

1.9 TUNEL 染色檢測腦細(xì)胞凋亡

取出3 組大鼠腦組織，石蠟包埋后切片，切片脫蠟后加入蛋白酶K 工作液，放置孵育箱中進行孵育，孵育溫度為37℃，20 min 后將TUNEL 反應(yīng)液加入，再孵育1 h，保證孵育環(huán)境全程避光，洗滌后將酶標(biāo)記抗體加入其中，同等環(huán)境繼續(xù)孵育30 min，最后用DAB 顯色10 min，再用蘇木精進行復(fù)染，封片后在顯微鏡下選取5 個清晰的高倍視野進行觀察，計算細(xì)胞的凋亡率。

1.10 免疫組織化學(xué)顯色檢測GFAP 和BDNF 的表達

將3 組大鼠的腦組織用福爾馬林鈉溶液浸泡，石蠟包埋、切片、免疫組織化學(xué)顯色。陽性細(xì)胞為胞質(zhì)清晰，且呈棕色顆粒狀；陰性細(xì)胞為無棕色染色顆粒。用圖像分析儀對陽性反應(yīng)物和陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)進行測定。其中A 為陽性細(xì)胞數(shù)量的分級[14]，0～1%=0+，>1%～10%=1+，>10%～50%=2+，>50%～80%=3+，>80%～100%=4+；陽性細(xì)胞顯色程度分級用B 表示，陰性為0，弱陽性為1，陽性為2，強陽性為3，最后對免疫組織化學(xué)顯色進行評分。陽性細(xì)胞數(shù)量的分級乘以陽性細(xì)胞顯示程度分級即為免疫組織化學(xué)評分。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

與假手術(shù)組（17.12±0.52）大鼠相比較，ICH組（8.94±2.36）大鼠的神經(jīng)功能障礙評分顯著減少（P<0.05）；與ICH 組相比，DA 組（11.96±0.15）大鼠的神經(jīng)功能障礙評分顯著增加（P<0.05）。

2.2 大鼠神經(jīng)元形態(tài)比較

與假手術(shù)組尼氏小體數(shù)量（124.5 個±10.3 個）比較，ICH 組尼氏小體數(shù)量（35.1 個±5.6 個）顯著減少（P<0.05）；與ICH 組相比，DA 組尼氏小體數(shù)量（82.7 個±7.8 個）明顯增加（P<0.05）（圖1，見封二）。

圖1 大鼠神經(jīng)元形態(tài)比較（尼氏染色，標(biāo)尺=50 μm）。

2.3 大鼠腦水腫情況比較

與假手術(shù)組（77.82%±1.32%）大鼠相比，ICH 組（85.91%±1.82%）大鼠腦組織含水量明顯增加（P<0.05）；與ICH 組相比，DA 組（78.56%±1.33%）大鼠腦組織含水量明顯減少（P<0.05），表明多巴胺可有效改善大鼠腦水腫情況。

2.4 大鼠腦組織形態(tài)變化比較

與正常的腦組織形態(tài)相比，ICH 組大鼠的腦組織出現(xiàn)了不同程度的水腫，其中一部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的腫脹，間質(zhì)之間明顯增寬，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受到了嚴(yán)重的破壞，嚴(yán)重的神經(jīng)元出現(xiàn)壞死，且有大量的炎性細(xì)胞浸潤；干預(yù)后的DA 組大鼠的腦組織形態(tài)得到了明顯的改善（圖2，見封二）。

圖2 大鼠腦組織H-E染色圖，標(biāo)尺=50 μm。

2.5 腦細(xì)胞凋亡情況比較

結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠無凋亡細(xì)胞。ICH組腦細(xì)胞凋亡率顯著多于假手術(shù)組（P<0.05）；與ICH 組大鼠相比，DA 組腦細(xì)胞凋亡率顯著減少（P<0.05）（圖3，見封二）。

圖3 大鼠腦組織TUNEL染色圖，標(biāo)尺=50 μm。

2.6 大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 蛋白表達比較

與假手術(shù)組大鼠相比較，ICH 組大鼠腦組織中GFAP 陽性表達增加，BDNF 蛋白陽性表達顯著降低（P<0.05）；與ICH 組大鼠相比，DA 組大鼠腦組織中GFAP 陽性表達顯著降低，BDNF 蛋白陽性表達明顯增多（P<0.05）（圖4、5，見封二）。

圖4 大鼠腦組織中GFAP（A1～C1）和BDNF（A2～C2）蛋白免疫組織化學(xué)顯色，標(biāo)尺=50 μm。

圖5 3 組大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 蛋白表達比較

3 討論

腦出血通常是指原發(fā)性、且非外傷引起的腦實質(zhì)內(nèi)出血，占所有腦卒中的30%以上，其中有50%的患者在發(fā)病后1 個月內(nèi)死亡，因此腦出血一直以來都備受臨床的廣泛關(guān)注[15]。目前對腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的有效保護，不僅可以減輕患者的腦出血癥狀，還能一定程度降低死亡率和致殘率[16]。當(dāng)前在臨床上有多種神經(jīng)保護劑，但治療的效果都不是非常滿意，多種因素綜合干預(yù)腦損傷的神經(jīng)元損傷是其主要的一種原因，因此單純的依靠藥物治療很難取得理想療效。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞活性混合物的研究中，一種或幾種可能傳輸一個早期信號給調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，疼痛相關(guān)的生理化合物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后被加強，其主要是讓調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的運輸大量減少，并且對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的活性進行了抑制。多巴胺和P 物質(zhì)等都在腦組織和免疫系統(tǒng)中有一定的作用，并且彼此之間能相互作用[17]。但通過實驗研究顯示，T 細(xì)胞的生物活性只有多巴胺能進行有效降低，并且多巴胺多是通過ERK 依賴途徑完成[18]。多巴胺能對物質(zhì)的活性進行抑制。顧新霞等[18]在對小鼠的實驗研究中，讓小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生一定的機械性和化學(xué)性的損傷，用多巴胺或D1 受體刺激劑給予小鼠干預(yù)治療，由此發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受到一定的保護，其可能是通過抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的活性來完成的。本實驗通過對腦出血大鼠模型給予多巴胺進行干預(yù)治療，觀察多巴胺對腦出血損傷的作用，以及探討其對腦組織中GFAP 和BDNF 蛋白的影響。

腦出血患者中最為常見的并發(fā)癥之一是神經(jīng)功能障礙，在臨床上主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍和記憶力下降等[19-20]。本研究結(jié)果顯示，腦出血大鼠模型的神經(jīng)功能障礙明顯加重，且神經(jīng)細(xì)胞的活性明顯降低；經(jīng)過多巴胺干預(yù)治療后大鼠的神經(jīng)功能和細(xì)胞的活性均得到了顯著改善。對比3 組大鼠的腦水腫情況顯示，腦出血大鼠的水腫情況明顯加重，多巴胺治療后大鼠的腦水腫情況得到了顯著的改善，可見多巴胺可一定程度的減輕大鼠的神經(jīng)功能障礙，同時讓腦水腫得到明顯改善。賈志英等[21]通過實驗研究證實，對于輕度及中度腦缺血缺氧的新生兒，在早期給予多巴胺聯(lián)合納洛酮進行干預(yù)治療，新生兒領(lǐng)域評分均得到了顯著提高，同時改善患兒神經(jīng)行為發(fā)育情況。在腦出血發(fā)生后，腦組織會出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡甚至死亡。本研究結(jié)果顯示，腦出血大鼠腦組織中可見大量的凋亡細(xì)胞，給予多巴胺治療后大鼠腦組織細(xì)胞凋亡明顯減少，并且該組大鼠的腦組織形態(tài)也得到了明顯改善。俞茹云等[22]通過動物實驗研究顯示，多巴胺可有效減少炎癥小體的活性，其可能是通過CART 進行，從而保護缺血性腦卒中大鼠的腦組織。

在腦組織中，GFAP 是一種較為特殊的中間絲蛋白，也是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的主要標(biāo)志物，作為細(xì)胞骨架的GFAP 可有效對抗細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，GFAP 在腦出血大鼠腦組織中表達升高，可見腦出血大鼠腦組織中GFAP 呈高表達。在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，神經(jīng)元的正常功能和活性均需BDNF 進行維持，BNDF 可為損傷的神經(jīng)元提供必要的營養(yǎng)，同時還能讓中樞神經(jīng)損傷后的運動和感覺功能得到有效恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，ICH 組大鼠腦組織中BDNF 的表達顯著低于假手術(shù)組，DA組大鼠腦組織中的BDNF 表達得到了顯著提高。袁宇等[23]研究表明，多巴胺能有效上調(diào)腦出血大鼠腦組織中GFAP 和BDNF 的表達，對神經(jīng)癥狀的好轉(zhuǎn)有一定促進作用。劉宇明等[24]對腦出血患者研究顯示，患者血清中NSE、GFAP 和BDNF 的表達影響腦出血后患者的認(rèn)知功能障礙，因此腦出血患者的認(rèn)知功能障礙可用NSE、GFAP 和BDNF 的表達來進行判斷。

綜上，多巴胺能抑制腦組織中GFAP 表達，促進BDNF 表達，改善腦出血腦組織的神經(jīng)功能障礙，進而對出血性腦卒中受損腦組織起到保護作用。