張小輝 王海偉 孫 穎 王 靜 王云鵬

（1 邯鄲市中心醫(yī)院病理科，邯鄲 056001；2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050017）

胃癌死亡率僅次于肺癌[1]，其發(fā)病率與患者年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，男女患者人數(shù)比例約為2∶1[2]，該病患者年齡呈年輕化趨勢[3]。大多數(shù)患者確診胃癌時通常已屬進(jìn)展期，治療方案較為復(fù)雜、難度升高，傳統(tǒng)的手術(shù)及放化療治療預(yù)后較差。研究顯示早期胃癌經(jīng)有效診斷，并及時干預(yù)治療，患者存活率可提高至90%以上，而晚期胃癌患者的術(shù)后存活率不超過30%。因此尋找簡單、有效的早期胃癌篩選方法非常重要。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化酶，能夠在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯和代謝以及腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。cAMP 反應(yīng)序列結(jié)合蛋 白（cAMP responsive element binding protein，CREB）通過蛋白激酶磷酸化激活后可持續(xù)刺激重要目標(biāo)基因表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[6]。在胃癌進(jìn)程中均檢測到PI3K、CREB 異常表達(dá)，提示其可能參與了胃癌細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)程[7]。本研究重點探討胃癌病理類型及分期與胃癌組織中PI3K/CREB 表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2017年6月～2019年6月于本院治療的140 例手術(shù)治療的胃癌患者，取患者胃癌組織以及癌旁1 cm 處組織石蠟包埋，存于-80℃液氮?；颊咧形荒挲g52.3 歲±4.9 歲，其中男性患者76 例、女性患者64 例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次胃癌根治術(shù)治療患者；③均存在明確TNM 分期及組織學(xué)分級的患者；④患者知情，且無條件配合此項目研究。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①經(jīng)過放化療冶療的患者；②患者資料不完整；③合并其他惡性腫瘤或重要器官衰竭。

1.4 試劑

兔抗人多克隆抗體及單克隆抗體（美國Abcom 公司）；DNA 裂解液（武漢碧云天Co.Ltd）；以及PBS 緩沖液（南京金益柏Co.Ltd）；DAB 顯色劑（北京金克隆Co.Ltd）；免疫組織化學(xué)SP 試劑盒（武漢艾迪抗Co.Ltd）等。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測陽性細(xì)胞

1.5.1 免疫組織化學(xué)檢測 取樣本脫蠟水化，H2O2失活，低火加熱1 min 修復(fù)抗原，加血清封閉，然后加一抗，PBS 沖洗，再加入二抗，最后加入DAB 顯色劑染色，PBS 清洗，全程按照說明書操作，顯微鏡隨機(jī)選5 個視野觀察結(jié)果。

1.5.2 染色結(jié)果判斷 胃癌組織中的陽性信號為淡黃色至棕褐色，CREB 陽性位于細(xì)胞核，PI3K 陽性定位于細(xì)胞質(zhì)。

1.5.3 4 級記分評價方法 具體評價方法見表1。

表1 記分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 免疫印跡檢測蛋白表達(dá)

取胃癌組織50 mg 加入裂解提取蛋白，分裝后于-20℃凍存，提取組織中總蛋白測定濃度，100 V SDS-PAGE 對總蛋白進(jìn)行電泳，然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后TTBS 漂洗，間隔10 min，一共3 次漂洗，最后加入二抗，常溫環(huán)境中封閉1 h，取出PVDF 膜TTBS 漂洗3 次，每次10 min，GAPDH 作內(nèi)參，DAB 顯色后照相。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0 軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，PI3K、CREB 蛋白表達(dá)采用n（%）或±s（符合正態(tài)分布）表示，行χ2或t檢驗進(jìn)行比較，生存率比較采用log-rank 檢驗，GraphPad Prism 7 繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），以P<0.05 判斷為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI3K/CREB 在胃癌組織、癌旁組織陽性表達(dá)率

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，PI3K 在胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中呈顆粒狀陽性表達(dá)，分布不均勻，CREB 在胃癌細(xì)胞核中呈現(xiàn)陽性棕黃色顆粒表達(dá)。PI3K 在胃癌組織中的陽性率是68.57%，在癌旁組織中陽性率為35.71%，兩者對比，前者陽性率較高（P<0.05）；CREB 在胃癌組織中陽性表達(dá)率（72.86%）較癌旁組織（40.00%）明顯升高（P<0.05）（表2，圖1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測PI3K（A1、B1）/CREB（A2、B2）表達(dá)情況，標(biāo)尺=50 μm

表2 PI3K/CREB 在胃癌組織、癌旁組織中表達(dá)情況對比[n/（%）]

2.2 PI3K/CREB 在胃癌組織、癌旁組織蛋白表達(dá)量

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，胃癌組織中PI3K/CREB的蛋白表達(dá)量均高于癌旁組織（P<0.05）（圖2）。

圖2 胃癌組織、癌旁組織中 PI3K/CREB 蛋白表達(dá)

2.3 PI3K/CREB 陽性表達(dá)與臨床病理類型及分期的相關(guān)性

胃癌組織中PI3K、CREB 在低分化（81.72%，86.02%）、Ⅲ+Ⅳ期（79.05%，82.86%）中陽性表達(dá)率均高于其在高中分化（42.55%，46.81%）、Ⅰ+Ⅱ期（37.14%，34.29%）的表達(dá)（P<0.05）；PI3K、CREB 在其他臨床特征中的陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

表3 PI3K/CREB 陽性細(xì)胞數(shù)與臨床特征的相關(guān)性（n=140）

2.4 PI3K/CREB 蛋白相對表達(dá)量與臨床病理類型及分期的相關(guān)性

胃癌組織中PI3K、CREB 在低分化（0.934±0.029，0.729±0.059）、Ⅲ+Ⅳ期（0.732± 0.028，0.712±0.021）蛋白表達(dá)水平均高于高中分化（0.284±0.015，0.303±0.013）、Ⅰ+Ⅱ期（0.505±0.021，0.449±0.018）中的表達(dá)（P<0.05），在其他臨床特征中的PI3K、CREB 蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表4）。

表4 PI3K/CREB 蛋白表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性（n=140）

2.5 PI3K/CREB 表達(dá)與生存率的關(guān)系

96 例PI3K 陽性、106 例CREB 陽性表達(dá)患者5年內(nèi)生存率（19.00%，20.00%）低于PI3K、CREB 陰性表達(dá)患者（26.00%，25.00%），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。

圖3 PI3K/CREB 陰性、陽性患者的生存率比較

2.6 ROC 曲線分析

ROC 結(jié)果顯示，PI3K 診斷胃癌的ROC 曲線下面積（AUC）為0.765，靈敏度為78.64%、特異度為62.46%，CREB 診斷胃癌AUC 面積為0.774，靈敏度為70.93%、特異度為64.75%，說明檢測PI3K、CREB 水平對胃癌預(yù)后診斷具有重要意義（圖4）。

圖4 ROC 曲線分析

3 討論

胃癌是導(dǎo)致全球死亡率升高的主要原因，胃癌的發(fā)展也是多基因循序漸進(jìn)由少到多的累積性疾病，其中大量癌癥基因表達(dá)異常，目前已經(jīng)了解到多個致病因子在胃癌中活性升高，通過基因靶向干預(yù)的研究成為胃癌研究的熱點，但是當(dāng)前胃癌的治療靶點及相關(guān)靶向藥物尚不能滿足臨床需求，許多胃癌亞型治療效果不佳[8-9]。因此，開發(fā)新的靶點對于胃癌的早期診斷及有效治療至關(guān)重要。

本研究通過免疫組織化學(xué)法和免疫印跡檢測樣本中的PI3K/CREB 表達(dá)，結(jié)果顯示PI3K/CREB在胃癌組織中的表達(dá)更高，同時結(jié)果還顯示PI3K、CREB 陽性表達(dá)的患者術(shù)后生存率低于陰性表達(dá)患者，說明PI3K/CREB 與胃癌預(yù)后具有相關(guān)性。PI3K 在多種生長因子、細(xì)胞因子刺激下會出現(xiàn)異?；罨?，激活下游底物蛋白激酶B，導(dǎo)致其磷酸化，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞生長、分化和侵襲[11-12]。周詩瓊等[13]研究表明PI3K 在胃癌組織中過度表達(dá)與胃癌的發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。同時其研究還表明胃癌細(xì)胞分化程度越低，PI3K 蛋白表達(dá)量越高，說明PI3K 表達(dá)可促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展。PI3K 激活后可影響下游細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子、周期調(diào)控蛋白等靶分子，加快胃癌細(xì)胞分化，促使其轉(zhuǎn)換至合成DNA 期、有絲分裂期，抑制細(xì)胞凋亡，惡化病情。CREB 是一種能夠刺激基因轉(zhuǎn)錄的核內(nèi)蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、新陳代謝、控制細(xì)胞行為以及基因轉(zhuǎn)錄等方面扮演重要角色[14-15]。CREB 在非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等多種實體瘤中表達(dá)上調(diào)，且參與多種腫瘤的生物學(xué)行為如促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡等。CREB通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控其下游靶基因，參與腫瘤異常增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)行為。在胃癌中，CREB 高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及患者不良預(yù)后有關(guān)，并提示CREB 可能為胃癌的獨立預(yù)后標(biāo)志物[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，在低分化、Ⅲ+Ⅳ期的腫瘤組織中PI3K/CREB 的表達(dá)更高，說明PI3K/CREB 表達(dá)隨病情的進(jìn)展增強(qiáng)，與胃癌的惡性進(jìn)展有關(guān)。ROC 曲線結(jié)果顯示，PI3K 診斷胃癌AUC 面積為0.765，靈敏度為78.64%、特異度為62.46%，CREB 診斷胃癌AUC 面積為0.774，靈敏度為70.93%、特異度為64.75%，說明檢測PI3K、CREB 對胃癌診斷存在意義。PI3K 在惡性腫瘤中屬于原癌基因，能夠隨著惡性腫瘤變異過程其表達(dá)升高。徐艷山等[18]研究顯示，CREB 在胃癌組織中呈陽性表達(dá)，與患者低分化及病理分期相關(guān)。CREB位于人染色體2q33.3，己經(jīng)有多個研究報道其參與不同腫瘤類型的發(fā)生發(fā)展，通過下調(diào)CREB 能夠抑制胃癌生長、侵襲與血管生成。PI3K 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移，可以作為胃癌預(yù)后的獨立指標(biāo)[19]。Liu 等[20]報道，PI3K與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PI3K 與Akt 可能存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展。

綜上所述，PI3K、CREB 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與胃癌疾病進(jìn)展存在相關(guān)性，對胃癌預(yù)后診斷具有重要意義。