康助習 匡 黎 郭 俊 權瑞泉 魏 英

（國藥東風總醫(yī)院，1 腫瘤科，2 實驗中心，十堰 442000）

大約有八成的肝癌患者體內(nèi)的癌細胞已擴散至全身各器官組織中，因而無法通過手術進行根治[1-3]。同時，術后患者容易出現(xiàn)肝癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移，效果欠佳。目前對肝癌發(fā)病的分子機制仍然不清楚，有專家推測是多種原因共同導致[4-5]。大量研究表明，通過對肝癌分子發(fā)病機制的研究，進一步掌握與肝癌密切相關的信號通路來確定針對性的靶向性治療方案，對于阻止患者病情惡化、增加肝癌患者存活率具有重大意義，因此尋找抗肝癌的新靶點刻不容緩。有研究顯示[6-7]通過干預癌細胞的信號轉(zhuǎn)導通路在一定程度上可以控制病情進展。Hedgehog（Hh）信號通路在研究中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生存在密切關系[8-10]。而miRNA-132 則被證實在多種人類腫瘤（如乳腺癌、肝癌等）中檢驗結(jié)果含量均較低，顯示其具有抑癌基因的作用[11]。但是miRNA-132對Hh 信號作用的相關研究較少，目前尚不清楚。本研究以人肝癌HepG2 細胞為研究對象，探討miRNA-132 通過Hh 信號通路對HepG2 細胞凋亡的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞來源及分組

將在ATCC細胞庫購買的人肝癌HepG2細胞分為空白組（無轉(zhuǎn)染HepG2）、NC組（HepG2轉(zhuǎn)染miR-132-NC）、YJ組（HepG2轉(zhuǎn)染miR-132 mimics）。

1.2 實驗儀器與試劑

電泳儀、PCR 儀（北京由萊普特科學儀器）；流式細胞儀（北京德利卡生物技術）；miR-132 mimics，miR-132-NC（上海生工）；Transwell小室（北京明陽科華生物科技）；CCK-8 試劑盒（Dojindo，日本）；PVDF 膜（Millipore，美國）；恒溫搖床（成都蘇凈器材公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)

在DMEM 培育液（含有胎牛血清）中培養(yǎng)HepG2 細胞株。細胞數(shù)量為80%～90%時，進行胰蛋白酶消化，然后采取1 600 r/min 進行離心5 min，收集、重懸并培養(yǎng)細胞。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長HepG2細胞，接種于6孔板內(nèi)（1×104個/mL），22 h后，HepG2細胞融合度達到90%時，把4 μL脂質(zhì)體和200 μL緩沖液依次加入EP管中，充分混和20 min后，加入6孔板，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將miR-132 mimics、miR-132-NC轉(zhuǎn)染至HepG2細胞，轉(zhuǎn)染5 h后，繼續(xù)培養(yǎng)，采用qRT-PCR法檢測是否轉(zhuǎn)染成功。

1.5 RT-PCR 檢測miR-132 含量

將液氮冷凍的HepG2 細胞進行研磨，用TRIzol 進行總RNA 的提取，逆轉(zhuǎn)錄參照說明書執(zhí)行，將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA 進行熒光反應實驗。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，內(nèi)參采用GAPDH，變性3 min 95℃，變性5 s 95℃，退火1 min 60℃，共40 個循環(huán)。取平均值計算Ct 值，計算方法用2－△△Ct法。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 CCK-8 法檢測細胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的細胞稀釋（1×105/mL），培養(yǎng)0.5 d。在96 孔板中平鋪，數(shù)量增長到一定程度后加入CCK-8 10 μL。常溫靜置30 min，使用讀板器檢測450 nm OD 值。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將HepG2 細胞密度調(diào)整至1.2×106/mL，接種于6 孔板中培養(yǎng)。0.01 mol/L PBS 洗滌，1 650 r/min 離心5min，-4 ℃保存，PBS 洗滌3 次，水浴，吹打均勻，4℃避光孵育30 min。流式細胞儀進行流式上樣檢測。

1.8 Transwell 小室檢測細胞侵襲能力

各組HepG2 細胞接種數(shù)量為1×105/mL，將50 mg/mL 的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)。上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃培養(yǎng)24 h，取出小室，拭去膜上面的細胞，結(jié)晶紫染色，計算膜下面的細胞，即HepG2 侵襲細胞數(shù)。

1.9 免疫印跡檢測Shh 蛋白表達

將HepG2 細胞進行裂解，并提取核蛋白，將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按4∶1 的比例混均，煮沸變性。電泳后的50 μL 蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加脫脂奶粉封閉，時長為1 h。加入1 抗后進行TTBS 漂洗，3×10 min，最后加入二抗，常溫封閉1 h。取出PVDF 膜，進行TTBS 漂洗，DAB 顯色后數(shù)碼相機照相。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用軟件對空白組、NC 組、YJ 組HepG2 細胞凋亡情況及Shh 蛋白表達量等數(shù)據(jù)進行分析，空白組、NC 組、YJ 組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2 細胞中miR-132 相對表達量

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示（圖1），3 組對比，YJ組HepG2 細胞中miR-132 表達量最高（P<0.05），說明轉(zhuǎn)染成功。

圖1 3 組HepG2 細胞中miR-132 表達量

2.2 各組HepG2 細胞增殖情況

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，3 組對比，YJ 組HepG2細胞增殖數(shù)量最低（P<0.05），空白組HepG2 細胞的增殖與NC 組差異無統(tǒng)計意義（P>0.05），皆高于YJ 組（P<0.05）（圖2）。

圖2 3 組HepG2 細胞增殖情況

2.3 各組HepG2 細胞凋亡情況

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，YJ 組、NC組、空白組細胞凋亡率分別是23.07%±2.17%、3.39%±0.69%、3.32%±0.57%，與NC 組及空白組比較，YJ 組HepG2 細胞凋亡數(shù)量最多（均P<0.05），空白組細胞凋亡數(shù)量與NC 組對比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖3）。

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.4 各組HepG2 細胞侵襲情況

Transwell 小室檢測結(jié)果顯示，YJ 組細胞侵襲數(shù)量（58.60±5.32）與空白組和NC 組比較明顯降低（均P<0.05），NC 組細胞侵襲數(shù)量（95.32±9.32），與空白組（98.60±9.65））相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖4）。

圖4 肝癌HepG2 細胞侵襲情況

2.5 各組Shh 蛋白相對表達量

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，YJ 組Shh 蛋白相對表達量與空白組和NC 組相比明顯降低（P<0.05），NC 組Shh 蛋白相對表達量含量與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖5）。

圖5 3 組細胞中Shh 的蛋白相對表達量比較

3 討論

在中國最新的一次流行病調(diào)查報告中顯示，我國每年死于肝癌的人數(shù)約為43 萬，5年內(nèi)每1 萬名患者中僅有3 千左右的患者得以存活[12]。該病與普通肝臟疾病區(qū)分困難，所以很多患者錯過最佳治療時期。病情進展迅猛，多數(shù)患者在確診初期病情已發(fā)展到難以甚至無法控制的狀態(tài)[13]。普通藥物治療成效微弱，目前臨床還是依靠手術治療來控制病情發(fā)展。雖取得了一定成效，但對于改善患者生存率，增加患者生存時間的意義不顯著[14]。

miR-132 是在小鼠神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的一種生物內(nèi)源的非編碼小RNA，定位在人類染色體17p13[15]。目前已經(jīng)有研究顯示，其在腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮一定作用，在多種人類腫瘤（如大腸癌、肝癌等）中檢測含量較低，對癌細胞有抑制作用。楊波等[16]研究表明，miR-132 對于卵巢癌細胞的遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用，表明miR-132很有可能是一種新的腫瘤抑制基因。為了深入探究miR-132 在人肝癌HepG2 細胞中的生物學作用，本研究通過過表達質(zhì)粒miR-132 mimics 轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2 細胞，提升 miR-132 表達量。對空白組、NC 組、YJ 組人肝癌HepG2 細胞檢測結(jié)果顯示，與空白組及NC 組比較，YJ 組HepG2 細胞增殖數(shù)量最少，侵襲數(shù)量降低，細胞凋亡數(shù)量升高，結(jié)果說明miR-132 抑制HepG2 細胞增殖、侵襲，促進其凋亡。沙敏等[17]通過血清檢測顯示，血清miR-132在肝癌患者癌細胞中表達下降，其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中均有參與并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并且能夠通過靶向抑制GP73 的表達，降低GP73 活性發(fā)揮抑制肝癌增長作用。劉海斌等[18]通過轉(zhuǎn)染miR-132 模擬物進行實驗研究，結(jié)果顯示過表達的miR-132 對體內(nèi)外肝癌細胞有增殖抑制和凋亡誘導作用，miR-132 有望成為肝癌治療的新靶點。

Hh 信號通路是果蠅發(fā)育中相對保守的信號通路，其在器官形成的胚胎發(fā)育階段具有控制細胞生長與增殖、促進細胞分化的功能。近年來，研究表明該通路異常激活與多種腫瘤疾?。ㄈ缥赴?、直腸癌等）的發(fā)生存在較大聯(lián)系。沈依萌等[19]在其研究中顯示正常成人體內(nèi) Hh 信號通路不表達或很少表達，但在肝癌組織中可見 Hh 信號通路的異常激活，進而導致其下游靶基因的表達出現(xiàn)異常情況，促進肝癌發(fā)生及發(fā)展過程。趙洪川等[20]研究顯示Shh、Ptch 等Hh 信號通路基因在肝癌中表達量很高，提示Hh 信號通路在肝癌的發(fā)生和進展進程中存在異常激活的可能性，為肝癌的發(fā)病機制研究提供了新的思考方向。姚利等[21]研究表明 Shh蛋白表達在基因轉(zhuǎn)錄、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮了重大作用，其與腫瘤的高增殖活性密切相關。研究證實許多組織器官腫瘤的形成都與該基因異常表達有關。Shh 蛋白含量升高導致其與Ptch 蛋白結(jié)合，大量的Smo 蛋白從Ptch 蛋白中解脫后進入細胞核，激活了下游轉(zhuǎn)錄因子Gli，引發(fā)促細胞生長基因過度表達，進而導致細胞增殖。相反，當該蛋白表達被抑制時可發(fā)揮促凋亡作用。Hh 信號通路的異常表達可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了直接或間接作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Hh 通路的異常激活及miRNA 的表達變化在各類腫瘤中同時存在。Guo 等[22]在研究中探討了Glil 基因在肝癌中的表達情況及其與miR-132 表達量之間的相關性，通過實驗表明兩者在肝癌中可能具有協(xié)同作用。同時顯示miR-132 在肝癌中呈現(xiàn)低表達，并通過靶向抑制下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Glil 基因參與調(diào)控發(fā)現(xiàn)Hh 信號通路，發(fā)揮類似抑癌基因作用，能夠抑制肝癌細胞增殖并誘導其凋亡。Li 等[23]通過熒光素酶報道基因?qū)嶒烌炞C了miR-132 與Hh 配體Shh 之間的相互作用關系，實驗顯示miR-132 上調(diào)可以抑制Shh的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖過程，誘導肝癌細胞凋亡。以上研究結(jié)果均揭示miR-132 與Hh 的相互關聯(lián)影響了肝癌發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，YJ 組HepG2 細胞中Shh 蛋白表達量最低，與NC 組、空白組相比差距大，NC 組與空白組相比數(shù)據(jù)接近，提示過表達miR-132 后，Shh 蛋白表達量減少，發(fā)揮促凋亡作用。說明Shh 蛋白有可能成為肝癌的診斷標志物之一，為惡性腫瘤的靶向治療提供行之有效的靶點。

綜上所述，miR-132 能夠通過降低Hh 信號通路的表達水平發(fā)揮促人肝癌HepG2 細胞凋亡作用。