梁媛媛 涂 曄 安曉強 馬 琳 江 鍵△

（海軍軍醫(yī)大學(xué)，1 衛(wèi)勤系數(shù)理教研室，3 藥學(xué)院無機化學(xué)教研室，上海 200433；2 上海市東方醫(yī)院藥學(xué)部，上海 2001203；4 解放軍總醫(yī)院京西醫(yī)療區(qū)醫(yī)技保障科，北京 100041）

皮膚瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是纖維增生性疾病，屬于病理性瘢痕。機械刺激、遺傳、全身和受傷部位局部感染等因素可導(dǎo)致皮膚傷口異常愈合，引起增生性瘢痕的生長甚至形成瘢痕疙瘩[1]。目前國內(nèi)外治療瘢痕多采用藥物治療、手術(shù)治療和物理療法。但由于個體差異，各種治療方法的臨床療效有待觀察，有的所需時間長、痛苦大、容易反復(fù)等[2-3]。因此，進一步了解病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展機制及尋找更為有效的治療方法一直是研究重點[4-7]。已有研究表明，在增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的形成過程中，一個關(guān)鍵因素是傷口局部成纖維細胞過度增生和膠原等細胞外基質(zhì)異常積聚[8]?，F(xiàn)已證明，生物組織的行為是由電荷的流動所控制。駐極體作為一種方便易攜的“永電體”，具有長期且相對穩(wěn)定的帶電特性，已有研究表明其可以影響細胞周期、血管通透性、藥物透皮吸收速率等[9-12]。本研究建立在電生理學(xué)的基礎(chǔ)上，將駐極體靜電場應(yīng)用于病理性瘢痕生長過程，探討其對成纖維細胞生長和遷移的影響和可能機制，為病理性瘢痕的預(yù)防和治療提供新途徑和新思路。

1 材料和方法

1.1 駐極體的制備和分組

聚丙烯（polypropylene，PP）商品膜，膜厚為13 μm （日本東麗株式會社）；駐極體的等效表面電位通過振動電容靜電計（北京華晶科技有限公司）測量。駐極體制備方法參考文獻[10]。實驗分組如下：對照組為表面電位為0 的PP 膜，5 000 V 組為表面電位為5 000 V 駐極體，-5 000 V 組為表面電位為-5 000 V 駐極體。

1.2 實驗動物和主要試劑

新西蘭大白兔體質(zhì)量（2～2.5）kg，購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[動物合格證：SCXK（滬）2018-0001]。

胰酶、胎牛血清、1640 培養(yǎng)基等購于Gibco 公司；PBS 緩沖液購于Servicebio 公司；CCK-8 試劑盒購于東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；RNA 提取液購于武漢賽維爾生物科技有限公司；烏拉坦等常用試劑均購于中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司；熒光染料碘化丙啶（PI）等購于南京沃博生物公司。

1.3 兔耳瘢痕模型制備

碘伏消毒兔耳，20%烏拉坦（1 g/kg）耳緣靜脈注射麻醉，每只兔耳腹側(cè)用直徑10 mm 打孔器造成圓形切口，完整切除全層皮膚，骨膜分離器剝離軟骨膜，保留耳軟骨，創(chuàng)傷間距大于1 cm。術(shù)后7 d 去除結(jié)痂，造成2 次創(chuàng)面。

1.4 瘢痕增生指數(shù)測量和成纖維細胞提取

兔耳創(chuàng)面形成后，自然愈合2 周。選取創(chuàng)面色紅、質(zhì)地硬、無毛發(fā)生長，高于周圍正常皮膚的明顯形成瘢痕的組織。然后按照分組分別外敷不同極性駐極體。每組隨機分配1 只兔，駐極體每3 d 更換1 次。分別按實驗?zāi)康碾S機取不同時間點的4～12 個瘢痕組織，將各組取下的瘢痕組織進行測量。

瘢痕成纖維細胞的提取方法按文獻[13]進行。

1.5 細胞增殖活性檢測

采用CCK-8 法檢測瘢痕細胞增殖活性，通過檢測活細胞線粒體脫氫酶的數(shù)量反映細胞增殖率。取對數(shù)生長的成纖維細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，將表面電位為0 V、-5 000 V 和5 000 V 駐極體分別作用成纖維細胞48 h 后，加入CCK-8 試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h 后，振蕩搖勻后用全自動酶標儀在450 nm 波長處測定各組細胞的吸光度值（OD 值，±s）。

式中空白組為無細胞的培養(yǎng)組。

1.6 細胞周期檢測

取第3 代對數(shù)生長期瘢痕成纖維細胞，在培養(yǎng)皿中各加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，后吸棄之，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱消化 2 min 后終止消化，制成2×107/mL 單細胞懸液，并接種于 6 孔培養(yǎng)板中。1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞 24 h 后換液，按實驗分組，將3 種不同表面電位的駐極體作用于瘢痕成纖維細胞，干預(yù) 48 h 后于流式細胞儀進行瘢痕細胞的細胞周期分析。與DNA 結(jié)合的PI 熒光強度反映細胞內(nèi)DNA 含量的多少。

1.7 細胞遷移能力檢測

取瘢痕成纖維細胞，消化、離心后，制成細胞懸液，按5×104個/孔種植于6 孔板中，當細胞在 6 孔板內(nèi)鋪滿至 80%時，于6 孔板中間劃痕，并用 PBS 沖洗懸浮細胞。記錄經(jīng)表面電位為0 V、5 000 V 駐極體和-5 000 V 駐極體分別作用0、12 h和24 h 后的細胞遷移情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用軟件 SPSS Statistics 19 進行統(tǒng)計分析，選用方差分析（正態(tài)分布，方差齊性）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 駐極體的電荷儲存穩(wěn)定性

經(jīng)常溫等離子體制備的不同表面電位正、負極性聚丙烯駐極體，其等溫表面電位衰減曲線不再贅述[10]。實驗表明常溫充電的正、負極性聚丙烯駐極體具有良好的電荷儲存穩(wěn)定性，可以用于兔耳瘢痕模型。

2.2 駐極體對瘢痕增生指數(shù)的影響

圖1分別顯示了兔耳瘢痕創(chuàng)面在第1 天、第7天和第42 天的大體組織生長情況。兔耳創(chuàng)面形成瘢痕組織后的第4 周、第5 周和第6 周，經(jīng)過不同極性的5 000 V 駐極體作用后，隨時間增加，對照組瘢痕增生指數(shù)逐漸增大，說明瘢痕增生程度逐漸增加；且與對照組相比，正、負5 000V 組駐極體作用后的瘢痕增生指數(shù)均明顯降低，說明不同極性的5 000 V 駐極體均對瘢痕生長有抑制作用，不同極性的5 000 V 駐極體的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

圖1 兔耳瘢痕模型創(chuàng)面的大體組織生長情況。

表1 創(chuàng)面形成后4～6 周各組瘢痕增生指數(shù)變化情況（n=4，±s）

表1 創(chuàng)面形成后4～6 周各組瘢痕增生指數(shù)變化情況（n=4，±s）

*P<0.05 vs 對照組

組別 4 周 5 周 6 周對照組 3.49±0.03 3.65±0.03 4.30±0.07 5000V 組 2.80±0.04* 3.08±0.06* 3.67±0.09*-5000V 組 2.79±0.05* 3.11±0.07* 3.69±0.06*

2.3 駐極體對瘢痕細胞增殖率的影響

5 000 V組和-5 000 V駐極體分別作用瘢痕成纖維細胞24 h后，與對照組比較，經(jīng)5 000 V駐極體作用24 h后，瘢痕成纖維細胞的OD值下降為0.96±0.02（P<0.05）。而經(jīng)-5 000 V駐極體作用24 h后的瘢痕成纖維細胞，其OD值上升為1.05±0.03（P<0.05）。且隨著駐極體與細胞作用的時間越長，其不同極性駐極體促進瘢痕成纖維細胞增殖或減少其增殖的作用有加強趨勢（表2）。提示 -5 000 V組在較短時間內(nèi)（72 h）對細胞增殖有促進作用，而5 000 V組則對細胞增殖有抑制作用。

表2 駐極體作用不同時間后瘢痕成纖維細胞的增殖率變化情況（瘢痕數(shù)n=12，±s）

表2 駐極體作用不同時間后瘢痕成纖維細胞的增殖率變化情況（瘢痕數(shù)n=12，±s）

*P<0.05 vs 對照組

組別 24 h 48 h 72 h對照組 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 5000V 組 0.96±0.02* 0.95±0.04* 0.92±0.04*-5000V 組 1.05±0.03* 1.07±0.04* 1.09±0.03*

2.4 駐極體對瘢痕成纖維細胞增殖周期的影響

5 000 V 組和-5 000 V 駐極體分別連續(xù)作用細胞48 h 后，與對照組比較，經(jīng)-5 000 V 駐極體作用48 h 的瘢痕成纖維細胞群中處于G1 期的細胞比例從26.81%±0.44%上升至72.26%±0.32%；而G2 期的細胞比例也顯著上升，從13.00%±0.13%增加至24.24%±0.73%，處于S 期的細胞數(shù)顯著減少（圖2）。

5 000 V 組作用成纖維細胞48 h，處于G1 期細胞的比例較對照組也有顯著上升，從26.81%±0.44%上升至80.07%±0.02%，而G2 期的細胞有比較明顯的下降，從13.00%±0.13%減少至10.07%±0.51%，處于S 期的細胞數(shù)稍有減少。這說明正極性駐極體產(chǎn)生的外靜電場使細胞阻滯于G1 期而抑制細胞生長（圖2）。

圖2 駐極體作用于瘢痕成纖維細胞48 h 后的流式細胞圖 （n=3）。

2.5 駐極體對瘢痕細胞遷移率的影響

與對照組比較，不同極性的5 000 V 組駐極體作用于瘢痕成纖維細胞較短時間內(nèi)（12 h）后，細胞遷移程度比較有限，細胞遷移數(shù)目均較對照組減少。而-5 000 V 組駐極體作用12 h，其抑制瘢痕成纖維細胞定向遷移的效果比較明顯（圖3），說明在短時間內(nèi)（12 h）負極性駐極體對瘢痕成纖維細胞的遷移有更強的抑制作用。

圖3 駐極體作用各組瘢痕細胞12 h 后細胞遷移的變化（n=3）。

3 討論

本研究從駐極體作用于瘢痕成纖維細胞的不同時間點展開，分別利用不同測量手段和方法從不同角度研究其作用機制。結(jié)果顯示：具有良好電荷儲存性能的正、負5 000 V 聚丙烯駐極體所提供的靜電場，在傷口形成的較短時間內(nèi)，有調(diào)控瘢痕細胞增殖的作用，但較長時間（4～6 周）的研究數(shù)據(jù)表明，不同極性的 5 000 V 駐極體均具有抑制瘢痕成纖維細胞生長的作用。此結(jié)果表明兩者在作用期間的具體機制方面可能略有不同。

-5 000 V組駐極體在12～48 h作用時間內(nèi)，可以在G1期促進遺傳物質(zhì)的復(fù)制，使細胞增殖率增加，但在S期則抑制DNA的過度合成，推測其可能使DNA合成減少或者使細胞DNA縮短停留在S期的時間，快速進入G2期，這與以前的研究結(jié)果有相似之處[14]。細胞遷移實驗結(jié)果提示負極性駐極體具有更強地抑制瘢痕成纖維細胞遷移的能力，推測這不僅與上述促進蛋白等物質(zhì)的合成有關(guān)，可能也與其電荷極性的調(diào)控有關(guān)[15-17]。電生理學(xué)研究表明細胞膜的電荷情況為內(nèi)負外正，負極性駐極體由于其極性與細胞膜外電荷異性，為細胞遷移提供了方向[18]。但負極性駐極體與活細胞作用后的不同時間段，兩者的相互作用隨著傷口組織的變化而產(chǎn)生不同的效果，瘢痕成纖維細胞在負極性駐極體作用4～7周的長時間調(diào)控作用下，負極性駐極體顯示出強大的調(diào)控性，瘢痕增生減少，抑制瘢痕生長。

5 000 V 駐極體在細胞增殖指數(shù)與增殖率方面與相同表面電位的負極性駐極體具有類似表現(xiàn)，而細胞周期檢測結(jié)果顯示正、負極性駐極體對細胞周期的作用存在差異。5 000 V 駐極體在G1 期促進蛋白等遺傳物質(zhì)的復(fù)制后，同樣具有抑制DNA 過度合成的作用，但在G2 期的細胞數(shù)量較S 期并沒有顯著增加，推測其可能并不是通過促進細胞周期快速度過S 期進入G2 期起作用，僅是通過正極性靜電場單純抑制DNA 的合成。

綜上所述，當細胞處于外靜電場環(huán)境下，靜電場作為外源刺激因子將引起瘢痕成纖維細胞的生長與遷移過程發(fā)生變化，且隨著駐極體作用時間的不同，正、負極性駐極體對瘢痕成纖維細胞的調(diào)控作用不同，正、負極性駐極體對瘢痕成纖維細胞的細胞周期影響也略有不同。兩種不同極性的駐極體有望分別應(yīng)用于不同時期的瘢痕生長過程，最終抑制病理性瘢痕增生。