程歲寒，覃先武，朱金玲，潘存鋒，張海波，張彥

(酵母功能湖北省重點實驗室，安琪紐特股份有限公司，湖北宜昌 443003)

維生素K2是一類含有2-甲基-1，4-萘醌母核結(jié)構(gòu)的脂溶性維生素，主要由微生物代謝產(chǎn)生。維生素K2在改善血壓、降低心腦血管疾病發(fā)生率以及預(yù)防骨質(zhì)疏松等方面具有重要的藥用價值。維生素K2又可表示為MK-n，n代表異戊二烯基團的數(shù)量。其中，七烯甲萘醌(MK-7)被認為是MK-n類物質(zhì)中生物活性和生物利用度較優(yōu)的成分之一。MK-7 在體內(nèi)參與骨代謝，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的功效，同時還能誘導(dǎo)肝癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤等的癌細胞凋亡，具有廣泛的抗癌功效［1-2］。日本、美國FDA 及歐盟先后批準(zhǔn)MK-7 作為食品及強化食品添加劑使用，2016 年中國國家衛(wèi)計委第8 號公告批準(zhǔn)MK-7 作為食品營養(yǎng)強化劑可在調(diào)制乳粉中使用［3］，并被國家市場監(jiān)督管理總局于2016 年發(fā)布的205 號公告收錄于保健食品原料目錄，適用于所有人群，其每日允許攝入量為10～100 μg［4］。

近年來，MK-7 因其保健功效顯著被廣大企業(yè)及消費者接受，市場上含MK-7 的保健食品多以油脂為基質(zhì)，而對于脂質(zhì)本底高的樣品，超聲提取法往往會引入嚴(yán)重的雜質(zhì)干擾。MK-7 檢測方法報道較少，主要有高效液相色譜-紫外(HPLC-UC)法［5-12］、高效液相色譜-熒光(HPLC-FLD)法［13-15］、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法［16-17］。2016 年國家衛(wèi)計委第8 號公告中規(guī)定了原料中維生素MK-7含量的測定方法，樣品用異丙醇超聲溶解后用反相色譜法進行測定［3］。許多報道中也使用異丙醇、乙酸乙酯、正己烷等酯溶性溶劑對樣品中的MK-7 進行提取，然后進行反相或正相色譜法測定［8-10］。此類方法操作簡便，但不適用于高油脂食品?？追踩A等［13］將高脂樣品經(jīng)脂肪酶酶解、異丙醇分散后，用正己烷提取樣品中的維生素K1和K2，采用高效液相色譜C18柱將維生素K1和K2與其它雜質(zhì)分離，再以鋅柱柱后還原，使非熒光化合物維生素K1和K2產(chǎn)生熒光，再經(jīng)熒光檢測器檢測，以外標(biāo)法定量，但此類方法樣品處理需要進行萃取、濃縮、復(fù)溶等步驟，操作復(fù)雜，耗時較長，易造成維生素K 損失，且需要高效液相色譜儀配置柱后衍生器，方法對人員及儀器要求較高。而HPLC-MS 設(shè)備成本較高，暫不易于推廣。

筆者擬建立保健食品中MK-7 的高效液相色譜測定方法，含油脂類食品經(jīng)脂肪酶水解以除去油脂的干擾，樣品中的MK-7 使用異丙醇提取后，經(jīng)C18型色譜柱分離，采用紫外檢測器測定，減少了萃取、復(fù)溶等操作。本方法操作便捷、準(zhǔn)確、快速，為保健食品中MK-7 的檢測和質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters e2695 型，配有2998 PDA 檢測器和Empower 色譜工作站，美國沃特世公司。

電子恒溫水浴鍋：DZKW-4 型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

電子天平：XS105 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

離心機：3-15 型，美國西格瑪公司。

MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.8%，批號為R080L0，美國默克公司。

脂肪酶：酶活不小于700 U／mg ，批號為BCCC7371，美國西格瑪公司。甲醇、異丙醇：均為色譜純，美國西格瑪公司。無水碳酸鉀：分析純，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

維生素K2保健食品樣品：軟膠囊、片劑，中國安琪紐特股份有限公司。

實驗用水為符合GB／T 6682 規(guī)定的一級水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Intersil ODS-3 C18型柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司)；流動相：甲醇-異丙醇(體積比為75∶25)，流量為1.0 mL／min；柱溫：40 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：270 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

MK-7 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL 棕色容量瓶中，加異丙醇溶解并定容，搖勻即得質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的MK-7 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃的冰箱中避光保存?zhèn)溆茫R用前稀釋至適宜濃度。

MK-7 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取MK-7 標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1、0.5、1、2、3、5 mL 于25 mL 棕色容量瓶中，加異丙醇定容至標(biāo)線，搖勻即得質(zhì)量濃度分別為0.4、2、4、8、12、20 mg／L 的MK-7 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用前配制。

1.2.3 樣品溶液的制備

軟膠囊樣品溶液（含油脂）：精密稱取含油脂的軟膠囊試樣0.5～4 g(約相當(dāng)于50～150 μg 的MK-7)于25 mL 棕色容量瓶，加入脂肪酶0.2 g、水10 mL，渦旋5 min，于37 ℃水浴4 h 以上。加入1 g 無水碳酸鉀，渦旋2 min，冷卻至室溫，用異丙醇定容至25 mL，搖勻，以5 000 r／min 離心5 min，上層液體過0.22 μm 有機濾膜。

片劑樣品溶液（不含油脂）：精密稱取不含油脂的片劑試樣2 g（約相當(dāng)于50～150 μg 的MK-7）于25 mL 棕色容量瓶，加入異丙醇15 mL，超聲10 min，冷卻，用異丙醇定容至標(biāo)線，搖勻，過0.22 μm有機濾膜。

1.2.4 計算

MK-7 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計算：

式中：X——樣品中MK-7 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg／g；

β——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試液中MK-7 的質(zhì)量濃度，μg／mL；

V——定容體積，mL；

m——取樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

以油脂為基質(zhì)的MK-7 保健食品試樣，易溶于酯溶性試劑異丙醇、正己烷等，參考木曉云等［3-5］的方法處理樣品，即不經(jīng)酶解直接提取后測定，發(fā)現(xiàn)樣品溶液雜峰較多，干擾較大。主要因為輔料玉米油、大豆油或其它油脂在220～280 nm 波長范圍內(nèi)均有較強的紫外吸收，色譜分析時，輔料油會在MK-7 色譜峰前后產(chǎn)生較多的雜峰，無法分離。脂肪酶是將油脂水解成脂肪酸和甘油的酶，具有對油水界面的親和力，并能在油水混合溶液中以高催化速率水解不溶于水的油脂。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)油脂量為4 g 時，加入0.2 g脂肪酶，以10 mL 水溶解，于37 ℃水浴4 h 以上可以將大部分油脂水解，加入碳酸鉀可以與殘留的少量油脂發(fā)生皂化反應(yīng)，進一步減少油脂的干擾。異丙醇無毒，與水有較好的互溶性，保健食品中MK-7的添加水平較低，試樣中MK-7 在異丙醇-水混合體系中可完全溶解，因此直接采用異丙醇定容，減少萃取、復(fù)溶等步驟，操作更簡單。

不含油脂的試樣則直接以異丙醇超聲提取，使MK-7 完全溶解后進行色譜分析。操作簡便、耗時較少。

2.2 專屬性考察

制備陰性樣品溶液進行HPLC 分析，考察空白溶液、陰性樣品中的其它輔料對MK-7 測定的影響，其專屬性考察結(jié)果見圖1。標(biāo)準(zhǔn)溶液中MK-7 保留時間為14.043 min(圖1a)，軟膠囊（含油脂）陰性樣品溶液(圖1b)、片劑（不含油脂）陰性樣品溶液(圖1d)均在14.043 min 處無色譜峰，說明輔料無影響，而含油脂樣品溶液(圖1c)、不含油脂樣品溶液(圖1e)在14.043 min 處出峰。MK-7 色譜峰理論塔板數(shù)為7 102，與其它雜峰分離度均大于2，證明方法專屬性強。

圖1 MK-7 色譜圖

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限

分別吸取MK-7 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液20 μL，進樣，以質(zhì)量濃度（x，mg／L）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。結(jié)果表明，MK-7 的質(zhì)量濃度為0.4～20 mg／L 的范圍內(nèi)與其色譜峰響應(yīng)值線性關(guān)系良好，線性方程為y=26 801x+25 301，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。取MK-7 對照品溶液適量，逐步稀釋，用液相色譜儀記錄其色譜峰高和信噪比，當(dāng)信噪比為3∶1 時，MK-7 的檢出限為0.06 mg／L。當(dāng)信噪比為10∶1 時，MK-7 的定量限為0.2 mg／L。

2.4 加標(biāo)回收與精密度試驗

2.4.1 含油試樣加標(biāo)回收試驗結(jié)果

準(zhǔn)確稱取不含MK-7 的維生素K2軟膠囊陰性樣品（內(nèi)容物為除MK-7 的油脂試樣）0.5 g 于25 mL 棕色容量瓶中，共9 份，加入脂肪酶0.2 g、水10 mL，渦旋5 min，于37 ℃水浴4 h。向樣品中添加低、中、高3 水平MK-7 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平平行測定3 次，加入1 g 無水碳酸鉀，渦旋2 min，用異丙醇定容至標(biāo)線，搖勻，以5 000 r／min 離心5 min，上層液體過0.22 μm 有機濾膜。按照1.2.1 色譜條件進行分析，以外標(biāo)法計算溶液中MK-7 的濃度，并分別計算每份溶液的回收率，結(jié)果見表1。由表1 可知，含油試樣的加標(biāo)回收率為94.6%～97.9%，平均回收率為96.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%。

2.4.2 不含油試樣回收試驗結(jié)果

準(zhǔn)確稱取不含MK-7 的維生素K2片陰性樣品1 g 于25 mL 棕色容量瓶中，共9 份，不經(jīng)酶解，向樣品中添加低、中、高3 水平MK-7 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平3 次平行，加入15 mL 異丙醇，超聲20 min，冷卻定容至標(biāo)線。搖勻，以5 000 r／min 離心5 min，上層液體過0.22 μm 有機濾膜。按照1.2.1 中的色譜條件進行分析，以外標(biāo)法計算溶液中MK-7 的濃度，并分別計算每份溶液的回收率，結(jié)果見表1。

表1 MK-7 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表1 可知，不含油試樣的加標(biāo)回收率為101.2%～104.4%，平均回收率為103.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%。

2.5 樣品測定結(jié)果

取4 種含MK-7 的保健食品，分別按1.2.3 處理方法制備樣品溶液，進行含量測定，測定結(jié)果列于表2。由表2 可知，實測值與投料理論值接近，說明本方法準(zhǔn)確度較高。

表2 MK-7 樣品測定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性及耐用性試驗

為考察樣品溶液穩(wěn)定性，按1.2.3 制備樣品溶液，在室溫條件下放置，分別在0、6、12 、24 h 測定其中MK-7 含量，考察含量是否發(fā)生變化。同時對色譜條件進行微小改變，如更換其它品牌C18色譜柱、柱溫調(diào)整為35 ℃和45 ℃，測定含量考察方法耐用性，結(jié)果見表3。由表3 可知，樣品溶液在24 h 內(nèi)測定，以及色譜條件微小調(diào)整后測定，4 種樣品的含量均未發(fā)生明顯變化，表明方法耐用性良好。

表3 穩(wěn)定性及耐用性試驗結(jié)果

3 結(jié)語

曾嘗試使用《GB 5009.158—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素K1的測定》中的樣品處理方法來測定維生素K2的含量，樣品需要經(jīng)過萃取、濃縮、復(fù)溶、衍生等步驟，而萃取過程易造成目標(biāo)成分的損失，準(zhǔn)確性低，樣品處理往往需要多次萃取，還需要進行加標(biāo)回收試驗或使用內(nèi)標(biāo)的方法，以確定待測成分的損耗是否影響實驗結(jié)果，操作復(fù)雜，耗時較長。

筆者經(jīng)過試驗，減少萃取等步驟，不含油脂的食品直接超聲提取，含油脂食品通過酶解去除油脂的干擾后，以異丙醇直接提取，大幅縮短了檢測耗時，提高了檢測效率。測定結(jié)果的準(zhǔn)確性經(jīng)方法學(xué)考察，本方法專屬性較強，具有良好的線性、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性。本方法不僅適用于MK-7 片劑保健食品，而且也適用于富含油脂的軟膠囊類保健食品中MK-7 的含量測定。