于浩洋，祁珍禎，朱冰雅，李顏巖

(遼寧省疾病預防控制中心，沈陽 110005)

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于氯霉素類抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有很強的活性，能抑制細菌蛋白質的形成，表現(xiàn)出廣譜抗菌能力，因其良好的抗菌性能，曾被廣泛應用到畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中［1］。當人們食用了使用氯霉素類抗生素的畜牧業(yè)或水產(chǎn)品后，氯霉素類抗生素會殘留于人體內(nèi)。隨著氯霉素類抗生素的大量使用，其不良作用也逐漸表露出來，可導致粒細胞缺乏癥、再生障礙性貧血、灰嬰綜合征等，嚴重威脅人類健康［2-3］。當前，世界上許多國家已禁止氯霉素類藥用于動物食品的生產(chǎn)，并規(guī)定了其在畜產(chǎn)品中最高殘留限量，美國、歐盟規(guī)定氯霉素殘留限量標準為“零容許量”，即不得檢出［4］。甲砜霉素和氟甲砜霉素抗菌譜與氯霉素相似，較氯霉素毒性有所降低，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，為保障食品安全，我國、歐盟等均制定了其在動物源性食品中的最大殘留限量［5-7］。

甲硝唑(MTZ)屬于硝基咪唑類抗生素，被普遍用于預防和控制蜜蜂孢子蟲病，對厭氧細菌十分有效［8］。硝基咪唑類藥物對哺乳動物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，通過食品接觸可能對人類健康構成潛在威脅［9-10］。歐盟EEC 2377／90 標準中，甲硝唑被列為禁止添加藥物［11］。我國農(nóng)業(yè)部最新頒布的第250 號公告《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留量》［12］中規(guī)定動源性食品中不得檢出氯霉素、甲硝唑，動物源性食品中甲砜氯霉素的最高殘留限量為50 μg／kg，氟甲砜霉素最高殘留限量（以氟苯尼考與氟苯尼考胺之和計）為100～3 000 μg／kg。

盡管國家已頒布了食品中抗生素殘留標準的相關政策，仍有部分蜂農(nóng)罔顧法紀，受利益驅使違規(guī)使用抗生素，近幾年偶有檢出陽性蜂產(chǎn)品［13-14］，給消費者的身體健康帶來危害，因此加強對蜂蜜中抗生素使用的把控與監(jiān)管，保障蜂蜜的食品安全非常必要。蜂蜜中甲硝唑或氯霉素類化合物的檢測方法很多［15-16］，主要有高效液相色譜(HPLC)法［17］、氣相色譜－質譜(GC－MS)法［18］、液相色譜-質譜聯(lián)用(LC－MS／MS)法［19-20］。由于甲硝唑與氯霉素類化合物的化學結構有較大差異，在溶劑中，氯霉素類化合物帶負電荷，甲硝唑帶正電荷，因此在使用液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測時，需要分別采用正離子和負離子掃描模式進行采集，較為繁瑣。目前，同時測定甲硝唑和氯霉素類化合物的方法報道較少，張琳等［21］使用液相色譜-質譜聯(lián)用法同時檢測動物源性食品中氯霉素和甲硝唑，但蜂蜜是一個高糖分、有機酸復雜的樣品，檢測的干擾性比較大，其沒有使用內(nèi)標或固相萃取柱凈化以消除基質干擾。筆者采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法以氯霉素-D5和甲硝唑-D4為內(nèi)標同時測定蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留，采用固相萃取柱凈化以達到消除基質干擾的目的，操作簡便快捷，定性定量準確，檢出限低，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能滿足同時檢測蜂蜜中甲硝唑和氯霉素類化合物的需要。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀：3200QTRAP型，美國AB 公司。

渦旋振蕩器：Lab Dancer 型，德國艾卡公司。

高速冷凍離心機：Thermo ST16R 型，美國賽默飛世爾公司。

電子天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

超純水系統(tǒng)：MILLI-Q Gradient 型，法國默克密理博公司。

高速離心機：TGL-16A 型，上海安亭科學儀器廠。

氮吹儀：urboVap LV 型，美國Caliper Life Science 公司。

固相萃取儀：Vac Elut SPS 24 型，美國安捷倫科技有限公司。

超聲波清洗器：KQ5200DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

Pall Corpration Acrodisc 針式濾器：孔徑為0.2 μm，直徑為13 mm，美國頗爾公司。

固相萃取柱：Oasis MCX 型，柱容積為6 mL,填料質量為150 mg，美國沃特世公司。

氯霉素-D5：編號為H409107AL，質量濃度為100 ng／μL，德國Dr. Ehrenstorfer 公司。

氯霉素、甲硝唑-D4、甲硝唑、氟甲砜霉素、甲砜霉素標準物質：編號分別為G974527、G174488、G133045、G169577、G988144，質量分數(shù)分別為99.8%、98.5%、96.2%、99.9%、99.3%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色譜純，美國費希爾公司。

甲酸：色譜純，美國福祿克公司。

乙酸銨：色譜純，德國CNW 公司。

氨水：分析純，西隴科學股份有限公司。

鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗用水水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國沃特世公司）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A 相為乙腈，B 相為5 mmol／L 乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）；流量：0.4 mL／min；進樣體積：10 μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 色譜分離梯度洗脫條件

1.2.2 串聯(lián)質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；離子噴霧電壓：5 500 V（正離子）～4 500 V（負離子）；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣壓力：413.7 kPa；輔助加熱器壓力：413.7 kPa；氣簾氣壓力：137.9 kPa；掃描方式：甲硝唑、甲硝唑-D4為正離子掃描模式，氯霉素、氯霉素-D5、氟甲砜霉素、甲砜霉素為負離子掃描模式。4 種抗生素及內(nèi)標質譜參數(shù)及保留時間見表2 所示。

表2 4 種抗生素及內(nèi)標的質譜參數(shù)及保留時間

1.3 實驗步驟

1.3.1 樣品預處理

準確稱取5 g 蜂蜜（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，向其中加入100 μL 20 ng／mL 的氯霉素-D5應用液、100 μL 20 ng／mL 的甲硝唑-D4應用液，加入10 mL 水，混勻溶解，再加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋提取3 min，以10 000 r／min 離心3 min，吸取乙酸乙酯相5 mL 于10 mL 試管中，40 ℃水浴氮氣吹干后，先加入0.1 mL 甲醇溶解，再加入1.9 mL 40 mmol／L 鹽酸溶液，渦旋30 s，轉入2 mL 離心管，15 000 r／min 離心3 min，上清液待凈化。

先后用6 mL 甲醇、6 mL 水、6 mL 40 mmol／L的鹽酸溶液活化平衡MCX 固相萃取柱，然后將上述上清液轉移至MCX 柱內(nèi)，待樣品過柱后，用6 mL 水淋洗除雜，真空抽干柱內(nèi)液體后加入5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集于氮吹管內(nèi)，得到洗脫液1；再用6 mL 甲醇淋洗除雜，真空抽干后用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集于氮吹管內(nèi)，得到洗脫液2；洗脫液1 和2 在40 ℃水浴下氮氣吹干，先向其中加入0.1 mL 甲醇溶解殘留物，再加入0.9 mL 10%甲醇-水溶液混勻，過0.22 μm 濾膜后上機分析。洗脫液1 用于分析氯霉素類抗生素，洗脫液2 用于分析甲硝唑。

1.3.2 溶液的配制

氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、甲硝唑單一標準儲備液：分別準確稱取4 種抗生素標準物質各0.010 g(精確到0.000 01 g)，以甲醇溶解并定容至10 mL，得到4 種抗生素質量濃度均為1.0 mg／mL的單一標準儲備液，于-20 ℃避光保存。

混合標準儲備液：準確移取4 種抗生素單一標準儲備液500 μL 于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，得到4 種抗生素質量濃度均為10.0 μg／mL 的混合標準儲備液，于-20 ℃下保存。

混合標準應用液：準確移取混合標準儲備液25 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，得到4種抗生素質量濃度均為25.0 ng／mL 的混合標準應用液，于4 ℃下保存。

氯霉素-D5應用液：準確移取50 μL 質量濃度為100 μg／mL 的氯霉素-D5標準物質于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，得到質量濃度為100.0 ng／mL 的氯霉素-D5儲備液，于-20 ℃保存；后用甲醇稀釋至20.0 ng／mL ，于4 ℃保存。

甲硝唑-D4應用液：準確稱取0.010 g（精確到0.000 01 g）甲硝唑-D4標準物質，用甲醇溶解并定容至100 mL，質量濃度為0.1 mg／mL ，于-20 ℃保存；后用甲醇稀釋至20.0 ng／mL，于4 ℃保存。

系列混合標準工作溶液：分別吸取25.0 ng／mL抗生素混合標準應用液0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mL，20.0 ng／mL 氯霉素-D5和甲硝唑-D4應用液各100 μL，25%乙腈-水溶液，定容至1.0 mL，制備成4 種抗生素的質量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng／mL 的系列混合標準工作溶液。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優(yōu)化

在電噴霧正負離子模式下對質譜條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)氯霉素、氯霉素-D5、甲砜霉素、氟甲砜霉素均能在負離子條件下電離，Q1 掃描時出現(xiàn)豐度較高的［M-H］-峰，而甲硝唑和甲硝唑-D4可在正離子條件下電離，Q1 掃描時出現(xiàn)豐度較高的［M+H］+峰。分別選擇［M-H］-峰作為氯霉素類的母離子、［M+H］+峰作為甲硝唑的母離子，對其進行碰撞解離。通過子離子掃描，得到碎片離子信息，再對去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化，使分子離子對的信號達到最強，每種化合物選擇2 對分子離子對，以響應較強的子離子作為定量離子，另一子離子作為定性離子?；衔锏馁|譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于甲醇和乙腈對絕大多數(shù)有機物具有較高溶解度，且二者具有低腐蝕性、低毒性、低粘性的特征，因此在液相色譜-質譜聯(lián)用儀的使用中多采用甲醇或乙腈作為有機相。此外，常在流動相中加入乙酸銨，可以有效提高目標化合物的響應并改善峰型［22-23］分別以相同比例的乙腈-5 mmol／L 乙酸銨溶液和甲醇-5 mmol／L 乙酸銨溶液作為流動相進行試驗，試驗結果發(fā)現(xiàn)，在甲醇-5 mmol／L 乙酸銨溶液體系中，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素響應較高，但甲硝唑響應偏低；在乙腈-5 mmol／L 乙酸銨溶液體系中，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素響應雖稍有下降，但甲硝唑響應值明顯升高，因此選用乙腈-5 mmol／L 乙酸銨溶液作為流動相。

由于甲酸在水中電離產(chǎn)生正離子，向水相中加入甲酸可以增加正離子掃描模式下甲硝唑的離子化效率，提高靈敏度。分別考察了0.01%、0.05%、0.1%三種濃度甲酸作為流動相時，對甲硝唑及氯霉素類化合物響應值的影響。試驗結果表明，甲酸濃度為0.05%時，在提高甲硝唑的離子化效率的同時，對氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的電離沒有顯著性影響，故B 相選用0.05%甲酸水溶液。

當樣品溶液的溶劑與流動相溶劑對樣品溶解度不同時，可能會造成峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。為防止溶劑效應的發(fā)生，試驗樣品先加入0.1 mL 甲醇超聲溶解殘留物，再加入0.9 mL 體積分數(shù)為10%的甲醇-水溶液，混勻后進樣?？捎行Х乐谷軇┬纳粕V峰峰型，提高響應值。

以乙腈-5 mmol／L乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）為流動相，采用Kinetex C18柱（100 mm ×2.1 mm，2.6 μm，美國沃特世公司）對4 種抗生素混合標準溶液進行分離，結果表明，梯度洗脫比等度洗脫分析時間短、色譜峰寬更窄，且能夠克服等度洗脫時待測物與干擾雜質一起流出，對待測物的離子化產(chǎn)生抑制作用以及色譜峰背景干擾的缺點。優(yōu)化的梯度洗脫程序見表1。在優(yōu)化條件下4 種抗生素提取色譜圖如圖1、圖2 所示。

圖1 氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的提取色譜圖

圖2 甲硝唑的提取色譜圖

2.3 前處理條件優(yōu)化

食品樣本分析過程中，樣本的前處理較為費力、費時，同時明顯影響分析結果的限速過程。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素和甲硝唑屬于弱極性物質，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑。通過考察證明，在3 種試劑中，乙酸乙酯提取率最高，因此選擇乙酸乙酯提取樣品。4 種抗生素需采用正負兩種掃描方式，因此采用的固相萃取小柱需對陰陽離子均有所保留。Waters Oasis MCX 固相萃取小柱屬于混合型陽離子交換反相吸附劑，其填料設計可以克服傳統(tǒng)硅膠基質混合型固相萃取吸附劑的局限性，提供了離子交換和反相離子交換的雙重保留模式。因此試驗采用乙酸乙酯從MCX 柱洗脫獲得氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素組分，采用5%氨化甲醇從MCX 柱洗脫獲得甲硝唑組分，分級凈化可有效去除干擾物質，滿足要求。

2.4 同位素內(nèi)標的使用

在質譜分析中，同位素內(nèi)標法是以穩(wěn)定同位素標記化合物作為內(nèi)標，利用待測物與內(nèi)標的響應豐度比值(峰面積比)進行線性回歸，通過對同位素豐度的準確質譜測量和對加入的內(nèi)標的準確稱量，做到對待測物的定量測定。該技術能有效消除基質干擾、具有檢測靈敏度高的優(yōu)點。

2.5 線性關系與檢出限

在1.2 儀器條件下測定1.3.2 配制的系列混合標準工作溶液，以待測化合物的質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得線性回歸方程及相關系數(shù)。以3 倍信噪比對應的質量濃度作為方法的檢出限。計算得到的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)及檢出限結果列于表5。由表5 可知，4 種抗生素質量濃度與對應的色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.08 μg／L。

表5 回歸方程、線性范圍、線性相關系數(shù)與檢出限

2.6 加標回收與精密度試驗

準確吸取18 份空白蜂蜜5 g 作為本底，分別加入高、中、低三個質量濃度水平的混合標準溶液，每個濃度水平平行6 次測定，樣品處理同前，上機測定，測定結果見表6。由表6 可知，4 種抗生素的平均加標回收率為90.2%～105.7%，測定結果的相對標準偏差為3.7%～8.9%，說明方法的精密度和準確度良好。

表6 4 種抗生素的加標回收、精密度試驗結果

3 結語

建立了一種HPLC-MS／MS 方法同時檢測蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素濃度，該方法對儀器條件和凈化過程進行了優(yōu)化，同位素內(nèi)標的使用可減少基質效應的影響，具有檢測快速、準確、檢出限低、靈敏度高等特點，適用于蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量的同時檢測。