李佩濂，姬文英

(榆林市藥品檢驗所，陜西榆林 719000)

氯米芬是具有順、反異構(gòu)的N，N-二乙基-2-［4-(1，2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基］乙胺化合物，穩(wěn)定性較差，通常以枸櫞酸鹽形式存在［1-4］。采用其為原料，另添加玉米淀粉、乳糖、蔗糖與硬脂酸鎂制得的枸櫞酸氯米芬片被臨床用于刺激女性卵泡發(fā)育、促使排卵，治療內(nèi)分泌不孕等癥狀［5-8］。制劑的主成分含量是評價產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標，決定了患者用藥劑量的準確，因此如何快速、準確測定枸櫞酸氯米芬片中枸櫞酸氯米芬的含量對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要的意義。

《中國藥典》2020 版中規(guī)定，枸櫞酸氯米芬片的主成分含量測定采用紫外吸光光譜法［9］，然而在測定波長下，藥物中其它共存物質(zhì)如降解雜質(zhì)、工藝雜質(zhì)、輔料等均會對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此方法專屬性較差，而高效液相色譜法可避免共存輔料和雜質(zhì)對樣品測定的干擾，克服上述缺陷［10-14］。白小紅等曾利用高效液相色譜法測定血液制品中枸櫞酸氯米芬的含量［15］；戰(zhàn)余銘等也曾采用高效液相色譜法測定配合飼料中氯米芬的含量［16］，結(jié)果均具有較好的準確度，但目前暫未有文獻報道高效液相色譜法測定枸櫞酸氯米芬片的含量。因此，筆者建立高效液相色譜法測定枸櫞酸氯米芬片中枸櫞酸氯米芬的含量，并按照相關(guān)指導原則要求進行方法驗證，以期為枸櫞酸氯米芬片的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260 型，安捷倫科技（中國）有限公司。

紫外分光光度計：UV-Power 型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

電子天平：BP190s 型，感量為±0.1 mg，賽多利斯天平有限公司。

枸櫞酸氯米芬對照品：質(zhì)量分數(shù)為99.2%，批號為100034-200503，中國食品藥品檢定研究院。

枸櫞酸氯米芬片：批號分別為20201101、20201105、20201201，塞浦路斯高特制藥有限公司。

甲醇、乙腈：色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

其余試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗用水為純化水。

1.2 溶液的配制

甲醇-水溶液：甲醇與水的體積比為55∶45，用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5。

枸櫞酸氯米芬對照品溶液：精密稱取枸櫞酸氯米芬對照品約25 mg，置于50 mL 容量瓶中，加入適量甲醇-水溶液，超聲溶解，冷卻至室溫，加入甲醇-水溶液定容，得0.5 mg／mL 對照品儲備液；精密移取對照品儲備液10 mL 至100 mL 容量瓶中，加入流動相定容后搖勻，得質(zhì)量濃度為0.05 mg／mL 的枸櫞酸氯米芬對照品溶液。

供試品溶液：取枸櫞酸氯米芬片20 片，研磨成細粉后，精密稱取適量(約相當于氯米芬50 mg)，置于100 mL 容量瓶內(nèi)，加入甲醇-水溶液適量，超聲溶解后，冷卻至室溫，繼續(xù)加入甲醇-水溶液定容后搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品儲備液；精密移取供試品儲備液10 mL，至100 mL 容量瓶內(nèi)，加入甲醇-水溶液，定容至標線后搖勻待用。

空白輔料溶液：根據(jù)枸櫞酸氯米芬片的處方，稱取玉米淀粉、乳糖、蔗糖與硬脂酸鎂適量，配制成相適應處方濃度的空白輔料溶液。

枸櫞酸氯米芬系列標準工作溶液：精密移取2、3、5、8、10 mL 枸櫞酸氯米芬對照品儲備液至50 mL容量瓶，加入流動相稀釋并定容至標線，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.02、0.03、0.05、0.08 和0.10 mg／mL 的系列標準工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters C18型柱(25 cm ×4.6 mm，4.5 μm，美國沃特世公司)；檢測波長：233 nm；流動相：甲醇-水溶液(體積比為55∶45，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)，流量為1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；進樣體積：50 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 色譜柱

分別選擇常用的Waters C18型色譜柱(25 cm×4.6 mm，4.5 μm)、Sepax C18型色譜柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)、Thermo C18型色譜柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)進樣考察。結(jié)果表明，采用Waters C18型色譜柱時，色譜峰理論塔板數(shù)大于8 000，相鄰峰分離度均大于2.0，且各峰拖尾因子均約為1.0，滿足檢測需要，而其它色譜柱峰形或相鄰峰分離度無法滿足要求，因此實驗選擇Waters C18型色譜柱。

2.1.2 流動相組成與流速

色譜常用有機相為甲醇或乙腈，分別考察不同有機相、組分比例和流量，設(shè)置甲醇的體積分數(shù)分別為45%、50%、55%，乙腈的體積分數(shù)45%、50%、55%，并分別考察0.8、1.0、1.2 mL／min 的流量。試驗結(jié)果表明，當采用乙腈作為洗脫劑時，目標物保留時間過短，且相鄰峰分離度僅為1.0 左右。在1.0 mL／min 的流量下，采用甲醇-水溶液(體積比為55∶45)作為洗脫劑時，色譜峰出峰時間合適，且相鄰峰之間分離度符合要求。因此選擇流動相為甲醇-水溶液(體積比為55∶45)，流量為1.0 mL／min。

2.1.3 分析波長

利用二極管陣列檢測器分別檢測順式與反式結(jié)構(gòu)的氯米芬化合物，特征光譜圖如圖1、2 所示。由圖1、2 可知，兩種結(jié)構(gòu)化合物均在233 nm 和290 nm 波長處有吸收，且在233 nm 處吸收較強，因此選擇分析波長為233 nm。

圖1 順式氯米芬紫外吸收光譜

圖2 反式氯米芬紫外吸收光譜圖

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

以枸櫞酸氯米芬對照品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，在1.3 色譜條件下進樣，色譜圖如圖3 所示。計算結(jié)果表明，氯米芬的順式與反式結(jié)構(gòu)化合物及其相鄰峰之間的分離度均大于1.5，主峰的理論塔板數(shù)均大于8 000，拖尾因子均在1.0 左右，系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果符合相應要求。

圖3 氯米芬對照品溶液色譜圖

2.3 專屬性試驗

精密移取上述供試品溶液5.0 mL 至4 只10 mL 容量瓶內(nèi)，分別按照表1 所述破壞條件對樣品進行破壞后測定，另外照1.3 色譜條件進樣測定空白輔料溶液。

表1 樣品破壞條件方法

試驗結(jié)果顯示，在不同破壞條件下，供試品溶液色譜圖中主峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，且主峰純度均大于990，表明降解雜質(zhì)對測定結(jié)果無干擾，同時空白輔料溶液在主峰保留時間處未出現(xiàn)色譜峰，表明制劑中其它共存組分對目標物的測定無影響。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取適量供試品溶液和枸櫞酸氯米芬對照品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h 后按照1.3 色譜條件進樣測定。試驗結(jié)果顯示，不同放置時間后供試品與對照品溶液中主峰面積的相對標準偏差均小于1.0%，表明供試品與對照品溶液于室溫放置24 h 內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。

2.5 線性范圍考察

分別移取1.2 制備的枸櫞酸氯米芬系列標準工作溶液50 μL，按照1.3色譜條件進樣，記錄色譜圖。以樣品質(zhì)量濃度(X，mg／mL)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸分析，計算回歸方程與相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，枸櫞酸氯米芬的質(zhì)量濃度在0.02～0.10 mg／mL 的范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=642.17X+0.45，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

2.6 精密度試驗

取同一批次樣品(批號為20201101)，配制供試品溶液6 份，按1.3 色譜條件進樣測定，結(jié)果列于表2。由表2 可知，測得含量分別為101.1%、100.7%、101.4%、100.3%、100.5%、99.4%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.69%，可知該方法精密度較高。

表2 精密度試驗結(jié)果 %

2.7 加標回收試驗

按照80%、100%、120%三個濃度水平，分別向9 份空白輔料溶液中加入適量枸櫞酸氯米芬對照品，配制成含枸櫞酸氯米芬的質(zhì)量濃度分別為0.040、0.050、0.060 mg／mL 的加標供試品溶液，每個濃度水平樣品平行各制3 份，照1.3 色譜條件進樣，測定結(jié)果見表3。

表3 加標回收試驗結(jié)果

由表3 可知，不同濃度水平的樣品回收率為98.0%～102.5%，平均回收率為100.7%，表明該方法準確度較好。

2.8 樣品含量測定結(jié)果比較

采用高效液相色譜法與紫外吸收光譜法分別檢測3 批枸櫞酸氯米芬片中枸櫞酸氯米芬的平均含量（質(zhì)量分數(shù)），結(jié)果見表4。從表4 可知，兩種分析方法測得結(jié)果相近，最大絕對偏差僅為2.1%，但高效液相色譜法測定結(jié)果較小，這可能歸因于色譜法專屬性較好，可將具有相同波長吸收的共存物質(zhì)干擾排除，因此測定結(jié)果更為準確。

表4 不同方法的測定結(jié)果(n=6) %

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法測定枸櫞酸氯米芬片中枸櫞酸氯米芬的含量。該方法專屬性較好，可避免其它方法測定時輔料和共存雜質(zhì)對樣品測定的干擾，方法操作簡便，流動相無需使用緩沖鹽，從而避免損害色譜柱的性能，測定結(jié)果具有較好的精密度與準確度，可推廣用于枸櫞酸氯米芬片的質(zhì)量控制。