張江維,張弦,肖樹雄
(廣東省藥品檢驗所,廣州 510663)
對乙酰氨基酚,又名撲熱息痛,是一種常用的非甾體類抗炎藥,具有解熱、鎮(zhèn)痛的作用,臨床上常用來治療感冒、發(fā)熱及各種原因?qū)е碌奶弁吹劝Y狀。非甾體類抗炎藥一般為口服和外用,目前已上市了數(shù)10 種非甾體類抗炎藥(NSAIDs)外用制劑,涵蓋了8 種劑型、10 余種藥物[1]。外用制劑作用機制與口服給藥一致,當(dāng)藥物達(dá)到局部病灶部位后,通過抑制前列腺素合成過程中的COX 來抑制炎癥[2-3],可提供與口服相當(dāng)?shù)目寡祖?zhèn)痛效力,且具有較輕微的全身不良反應(yīng)。但不正當(dāng)、長期或大量使用該藥,可引起嚴(yán)重肝毒性,甚至導(dǎo)致急性肝衰竭[4-5]、哮喘[6]、高血壓[7]、胃腸道及藥疹或皮膚損害[8-9]等不良反應(yīng)。
近年來在部分宣稱護膚、保濕類護膚品的監(jiān)督抽檢中篩查出對乙酰氨基酚陽性化妝品。根據(jù)《已使用化妝品原料目錄名稱(2021 年版)》[10]中規(guī)定:“對乙酰氨基酚在淋洗類產(chǎn)品中最高歷史使用量為0.05%,但未提供駐留類產(chǎn)品最高歷史使用量(%)”、“對目錄未提供最高歷史使用量的原料,化妝品注冊人、備案人可按照《化妝品安全評估技術(shù)導(dǎo)則》要求,提供相應(yīng)的材料作為評估證據(jù),或者按風(fēng)險評估程序進(jìn)行安全風(fēng)險評估,確保原料的使用安全”。此次篩查出的兩批對乙酰氨基酚陽性化妝品均屬于駐留類產(chǎn)品且為嬰幼兒類產(chǎn)品?;瘖y品中對乙酰氨基酚大致來源于以下情況,一是人為添加,少量添加可緩解產(chǎn)品成分的刺激或配合修復(fù)類產(chǎn)品以減少炎癥對修復(fù)的影響;二是原料污染;三是生產(chǎn)藥品時流水線上的藥品殘留。由于對乙酰氨基酚屬于非甾體類抗炎藥,會引起皮膚不良反應(yīng),對阿司匹林過敏的患者禁用,為保護人們身體健康,有必要對化妝品中對乙酰氨基酚含量進(jìn)行檢測。
目前對乙酰氨基酚常見檢測方法有液相色譜法[11]、氣相色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13]、化學(xué)熒光法[14]、電化學(xué)方法[15]等,但大多數(shù)的相關(guān)方法報道主要集中在藥品含量測定及臨床研究、代謝組學(xué)[16]等方面,國內(nèi)尚未有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報道關(guān)于化妝品中對乙酰氨基酚的檢測研究,因此筆者建立高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用確證法(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法)測定凝膠、膏霜、化妝水、乳液類化妝品中對乙酰氨基酚含量,為化妝品監(jiān)管提供技術(shù)支撐,同時也為后續(xù)相關(guān)研究工作提供參考。
液相色譜儀:LC-20AT 型,配二極管陣列檢測器,日本島津公司。
三重四級桿質(zhì)譜儀:LC/MS-8040 型,配島津液相色譜儀(LC-30AD 型),日本島津公司。
超聲波清洗器:M8800H-C 型,美國Branson公司。
電子天平:MS204SM 型,感量值為0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多公司。
超純水機:Milli-Q 2882 型,美國密理博公司。甲醇、乙腈:色譜純,美國Honeywell 公司。
對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度為99.9%(按C8H9NO2計),批號為100018-201610,中國食品藥品檢定研究院。
乙酸銨:色譜級,質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.0%,上海阿拉丁生化科技有限公司。
冰乙酸:色譜級,上海麥克林生化科技有限公司。
氨水:色譜級,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
護膚、保濕類、嬰幼兒類化妝品樣品:包含乳液、膏霜、化妝水、凝膠等,共48 批,市購。
實驗用水為一級水。
對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL,稱取對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50 mg(精確到0.000 1 g)至50 mL 容量瓶中,用甲醇定容至標(biāo)線。
對乙酰氨基酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,加入甲醇,配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200、400 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,待測。
0.01%氨水溶液:精密量取0.1 mL 氨水,加水定容至1 000 mL。
對乙酸銨溶液:0.02 mol/L,稱取1.54 g 乙酸銨,加入950 mL 水,用冰乙酸調(diào)pH 至4.2,加水至1 000 mL,經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾。
甲醇-乙腈-乙酸銨溶液:分別取200 mL 甲醇、100 mL 乙腈和700 mL 0.02 mol/L 乙酸銨溶液,混勻,真空脫氣,配成體積比為20∶10∶70 的混合溶液。
1.3.1 液相色譜條件
色譜柱:OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,日本OSAKA SODA 公司);流動相:甲醇-乙腈-乙酸銨溶液(體積比為20∶10∶70);檢測器:二極管陣列檢測器;檢測波長:245 nm;流量:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL。
對乙酰氨基酚對照品和陽性樣品(從化妝品監(jiān)督抽檢中篩查出含對乙酰氨基酚的化妝品)色譜圖見圖1、圖2。
圖1 對乙酰氨基酚對照品色譜圖
圖2 對乙酰氨基酚陽性樣品色譜圖
1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜條件
(1)液相色譜。色譜柱:GL Sciences Inc.C18型(150 mm ×3.0 mm,3 μm,日本GL Sciences 公司);柱溫:30 ℃;流量:0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:2 mL;流動相:A 相為0.01%氨水,B 相為甲醇,采用二元高壓梯度洗脫,梯度洗脫程序列于表1。
表1 梯度洗脫程序
(2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子化源(ESI);正離子模式;加熱塊溫度:400 ℃;DL 管溫度:250 ℃;霧化氣流量:3 L/min;干燥氣:N2,流量為15 L/min。質(zhì)譜分析參數(shù)列于表2;離子源與相對豐度比圖見圖3。
表2 對乙酰氨基酚質(zhì)譜分析參數(shù)
圖3 對乙酰氨基酚離子源圖
1.4.1 樣品處理
(1)液相色譜法。稱取樣品1.0 g(精確到0.001 g)至10 mL 比色管中,加入甲醇定容,振搖分散均勻,超聲20 min,用0.45 μm 濾膜過濾,濾液作為待測液。
(2)液相色譜-質(zhì)譜法。稱取樣品0.2 g(精確到0.001 g)于50 mL 具塞離心管中,加入10 mL 甲醇渦旋混勻,超聲提取15 min,以10 000 r/min 離心20 min,吸取2 mL 上清液于裝有50 mg C18吸附劑的10 mL 具塞比色管中,渦旋2 min,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,濾液作為待測液。
1.4.2 測定方法
取系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品待測液分別按1.3.1 和1.3.2 條件進(jìn)行測定。
參考文獻(xiàn)[11,17-18]及考察不同比例流動相。選擇相同質(zhì)量濃度的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以乙腈-乙酸銨溶液(體積比為30∶70)、甲醇-乙腈-乙酸銨溶液(體積比為20∶10∶70,乙酸銨溶液均為0.02 mol/L,冰乙酸調(diào)pH 至4.2)作為流動相,進(jìn)行對比試驗。試驗結(jié)果表明,以乙腈-乙酸銨溶液(體積比為30∶70)作為流動相時,對乙酰氨基酚色譜峰出峰時間較早,與溶劑峰有重疊,影響樣品分析;以甲醇-乙腈-乙酸銨溶液(體積比為20∶10∶70)作為流動相時,對乙酰氨基酚色譜峰出峰時間延后,能達(dá)到分離要求,且對乙酰氨基酚易溶于甲醇,便于樣品分析。因此選用甲醇-乙腈-乙酸銨溶液(體積比為20∶10∶70)作為流動相進(jìn)行洗脫。
對對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描,由結(jié)果可知,對乙酰氨基酚在245 nm 波長處有較強吸收,故選用245 nm 作為對乙酰氨基酚的檢測波長。經(jīng)48 批樣品檢測驗證,該波長條件下干擾較小,靈敏度較高,可滿足檢測方法需要。
參照《中國藥典》2020 年版[17]對乙酰氨基酚“在熱水或乙醇中易溶”和文獻(xiàn)[19-20],考察了不同提取溶劑對化妝品中非甾體類抗炎藥的提取效果。試驗選擇乙醇、甲醇和70%甲醇溶液作為對乙酰氨基酚提取溶劑進(jìn)行考察。
由試驗結(jié)果可知,在凝膠類化妝品中,甲醇和乙醇提取效率無明顯差異,70%甲醇溶液提取率較低;在膏霜類化妝品中甲醇提取效率最高,乙醇次之,70%甲醇溶液最低,且在實際操作中發(fā)現(xiàn),對于膏霜類樣品,使用70%甲醇溶液為提取溶劑時,樣品過濾較為困難。考慮到不同基質(zhì)類化妝品提取效率的差異和上機后存在的溶劑效應(yīng),選擇甲醇作為提取溶劑。
選用膏霜類和凝膠類兩批陽性樣品為待測對象,在相同條件下分別選取不同超聲時間(10、20、30 min)進(jìn)行測定。
試驗結(jié)果表明,對于膏霜類樣品,當(dāng)超聲提取10 min 后提取效果無明顯差異;對于凝膠類樣品,超聲提取時間對提取效果均無明顯差異??紤]到產(chǎn)品基質(zhì)的差異,故選取20 min 作為該方法的提取時間。
取1.2 中制備的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.3 色譜條件進(jìn)行測定。以待測組分質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用線性回歸法計算相關(guān)系數(shù)。由結(jié)果可知,對乙酰氨基酚的質(zhì)量濃度在10~400 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。
對對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋并檢測,按照3 倍的信噪比計算檢出限,得到對乙酰氨基酚的檢出濃度為0.01 μg/mL,則相應(yīng)檢出限為0.1 mg/kg。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表3。
表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限
選取化妝水、乳液、凝膠、膏霜4 種空白基質(zhì)樣品,每種基質(zhì)分別添加4 個水平的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,每一個添加水平平行測定6 份,計算加標(biāo)回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。
由表4 可知,樣品加標(biāo)回收率為97.73%~101.00%,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%~0.74%,表明所建立的分析方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。
表4 4 種空白基質(zhì)加標(biāo)回收率和精密度試驗結(jié)果
為考察對乙酰氨基酚在整個實驗過程中(24 h內(nèi))是否會降解或不穩(wěn)定等,從而導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈線性或樣品出現(xiàn)假陰性等不利狀況,對其進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。取1.2 中質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在不同時間點進(jìn)行測定,測得的色譜峰面積由線性回歸方程計算得到實際測量濃度,并計算測定結(jié)果的相對偏差,結(jié)果見表5。由表5 可知,在24 h 內(nèi)對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度無太大差異,表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定性良好。
表5 對乙酰氨基酚24 h 內(nèi)穩(wěn)定性測定結(jié)果
選取護膚、保濕類及嬰幼兒類產(chǎn)品包含乳液、膏霜、化妝水、凝膠等共48 批化妝品樣品進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)有兩批樣品檢出對乙酰氨基酚,檢出含量均為0.05%。兩批陽性樣品(某品牌修護凝膠和特護霜)使用說明均用于肌膚修護、滋養(yǎng)保濕及日常皮膚護理。為排除檢測過程中的人為污染因素,重新對這兩批同批號未開封樣品進(jìn)行檢測,并對樣品采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行確證,兩次檢測結(jié)果無明顯差異。因此,樣品中的對乙酰氨基酚非檢測過程中人為污染,均為生產(chǎn)帶入。
建立了化妝品中對乙酰氨基酚含量的高效液相色譜檢測方法,并由液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對陽性樣品進(jìn)行確證。此方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好,適用于化妝品中對乙酰氨基酚的定量檢測和結(jié)果確證。