張江維，張弦，肖樹雄

(廣東省藥品檢驗所，廣州 510663)

對乙酰氨基酚，又名撲熱息痛，是一種常用的非甾體類抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛的作用，臨床上常用來治療感冒、發(fā)熱及各種原因?qū)е碌奶弁吹劝Y狀。非甾體類抗炎藥一般為口服和外用，目前已上市了數(shù)10 種非甾體類抗炎藥（NSAIDs）外用制劑，涵蓋了8 種劑型、10 余種藥物［1］。外用制劑作用機制與口服給藥一致，當(dāng)藥物達(dá)到局部病灶部位后，通過抑制前列腺素合成過程中的COX 來抑制炎癥［2-3］，可提供與口服相當(dāng)?shù)目寡祖?zhèn)痛效力，且具有較輕微的全身不良反應(yīng)。但不正當(dāng)、長期或大量使用該藥，可引起嚴(yán)重肝毒性，甚至導(dǎo)致急性肝衰竭［4-5］、哮喘［6］、高血壓［7］、胃腸道及藥疹或皮膚損害［8-9］等不良反應(yīng)。

近年來在部分宣稱護膚、保濕類護膚品的監(jiān)督抽檢中篩查出對乙酰氨基酚陽性化妝品。根據(jù)《已使用化妝品原料目錄名稱（2021 年版）》［10］中規(guī)定：“對乙酰氨基酚在淋洗類產(chǎn)品中最高歷史使用量為0.05%，但未提供駐留類產(chǎn)品最高歷史使用量（%）”、“對目錄未提供最高歷史使用量的原料，化妝品注冊人、備案人可按照《化妝品安全評估技術(shù)導(dǎo)則》要求，提供相應(yīng)的材料作為評估證據(jù)，或者按風(fēng)險評估程序進(jìn)行安全風(fēng)險評估，確保原料的使用安全”。此次篩查出的兩批對乙酰氨基酚陽性化妝品均屬于駐留類產(chǎn)品且為嬰幼兒類產(chǎn)品?；瘖y品中對乙酰氨基酚大致來源于以下情況，一是人為添加，少量添加可緩解產(chǎn)品成分的刺激或配合修復(fù)類產(chǎn)品以減少炎癥對修復(fù)的影響；二是原料污染；三是生產(chǎn)藥品時流水線上的藥品殘留。由于對乙酰氨基酚屬于非甾體類抗炎藥，會引起皮膚不良反應(yīng)，對阿司匹林過敏的患者禁用，為保護人們身體健康，有必要對化妝品中對乙酰氨基酚含量進(jìn)行檢測。

目前對乙酰氨基酚常見檢測方法有液相色譜法［11］、氣相色譜法［12］、液相色譜-質(zhì)譜法［13］、化學(xué)熒光法［14］、電化學(xué)方法［15］等，但大多數(shù)的相關(guān)方法報道主要集中在藥品含量測定及臨床研究、代謝組學(xué)［16］等方面，國內(nèi)尚未有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報道關(guān)于化妝品中對乙酰氨基酚的檢測研究，因此筆者建立高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用確證法（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法）測定凝膠、膏霜、化妝水、乳液類化妝品中對乙酰氨基酚含量，為化妝品監(jiān)管提供技術(shù)支撐，同時也為后續(xù)相關(guān)研究工作提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC-20AT 型，配二極管陣列檢測器，日本島津公司。

三重四級桿質(zhì)譜儀：LC／MS-8040 型，配島津液相色譜儀（LC-30AD 型），日本島津公司。

超聲波清洗器：M8800H-C 型，美國Branson公司。

電子天平：MS204SM 型，感量值為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超純水機：Milli-Q 2882 型，美國密理博公司。甲醇、乙腈：色譜純，美國Honeywell 公司。

對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度為99.9%（按C8H9NO2計），批號為100018-201610，中國食品藥品檢定研究院。

乙酸銨：色譜級，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.0%，上海阿拉丁生化科技有限公司。

冰乙酸：色譜級，上海麥克林生化科技有限公司。

氨水：色譜級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

護膚、保濕類、嬰幼兒類化妝品樣品：包含乳液、膏霜、化妝水、凝膠等，共48 批，市購。

實驗用水為一級水。

1.2 溶液制備

對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：質(zhì)量濃度為1 000 μg／mL，稱取對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50 mg（精確到0.000 1 g）至50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線。

對乙酰氨基酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，加入甲醇，配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200、400 μg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待測。

0.01%氨水溶液：精密量取0.1 mL 氨水，加水定容至1 000 mL。

對乙酸銨溶液：0.02 mol／L，稱取1.54 g 乙酸銨，加入950 mL 水，用冰乙酸調(diào)pH 至4.2，加水至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾。

甲醇-乙腈-乙酸銨溶液：分別取200 mL 甲醇、100 mL 乙腈和700 mL 0.02 mol／L 乙酸銨溶液，混勻，真空脫氣，配成體積比為20∶10∶70 的混合溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本OSAKA SODA 公司）；流動相：甲醇-乙腈-乙酸銨溶液（體積比為20∶10∶70）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：245 nm；流量：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

對乙酰氨基酚對照品和陽性樣品（從化妝品監(jiān)督抽檢中篩查出含對乙酰氨基酚的化妝品）色譜圖見圖1、圖2。

圖1 對乙酰氨基酚對照品色譜圖

圖2 對乙酰氨基酚陽性樣品色譜圖

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜條件

（1）液相色譜。色譜柱：GL Sciences Inc.C18型(150 mm ×3.0 mm，3 μm，日本GL Sciences 公司)；柱溫：30 ℃；流量：0.3 mL／min；進(jìn)樣體積：2 mL；流動相：A 相為0.01%氨水，B 相為甲醇，采用二元高壓梯度洗脫，梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子化源（ESI）；正離子模式；加熱塊溫度：400 ℃；DL 管溫度：250 ℃；霧化氣流量：3 L／min；干燥氣：N2，流量為15 L／min。質(zhì)譜分析參數(shù)列于表2；離子源與相對豐度比圖見圖3。

表2 對乙酰氨基酚質(zhì)譜分析參數(shù)

圖3 對乙酰氨基酚離子源圖

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品處理

（1）液相色譜法。稱取樣品1.0 g（精確到0.001 g）至10 mL 比色管中，加入甲醇定容，振搖分散均勻，超聲20 min，用0.45 μm 濾膜過濾，濾液作為待測液。

（2）液相色譜-質(zhì)譜法。稱取樣品0.2 g（精確到0.001 g）于50 mL 具塞離心管中，加入10 mL 甲醇渦旋混勻，超聲提取15 min，以10 000 r／min 離心20 min，吸取2 mL 上清液于裝有50 mg C18吸附劑的10 mL 具塞比色管中，渦旋2 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液作為待測液。

1.4.2 測定方法

取系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品待測液分別按1.3.1 和1.3.2 條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

參考文獻(xiàn)［11，17-18］及考察不同比例流動相。選擇相同質(zhì)量濃度的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以乙腈-乙酸銨溶液（體積比為30∶70）、甲醇-乙腈-乙酸銨溶液（體積比為20∶10∶70，乙酸銨溶液均為0.02 mol／L，冰乙酸調(diào)pH 至4.2）作為流動相，進(jìn)行對比試驗。試驗結(jié)果表明，以乙腈-乙酸銨溶液（體積比為30∶70）作為流動相時，對乙酰氨基酚色譜峰出峰時間較早，與溶劑峰有重疊，影響樣品分析；以甲醇-乙腈-乙酸銨溶液（體積比為20∶10∶70）作為流動相時，對乙酰氨基酚色譜峰出峰時間延后，能達(dá)到分離要求，且對乙酰氨基酚易溶于甲醇，便于樣品分析。因此選用甲醇-乙腈-乙酸銨溶液（體積比為20∶10∶70）作為流動相進(jìn)行洗脫。

2.2 檢測波長的選擇

對對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，由結(jié)果可知，對乙酰氨基酚在245 nm 波長處有較強吸收，故選用245 nm 作為對乙酰氨基酚的檢測波長。經(jīng)48 批樣品檢測驗證，該波長條件下干擾較小，靈敏度較高，可滿足檢測方法需要。

2.3 提取溶劑的選擇

參照《中國藥典》2020 年版［17］對乙酰氨基酚“在熱水或乙醇中易溶”和文獻(xiàn)［19-20］，考察了不同提取溶劑對化妝品中非甾體類抗炎藥的提取效果。試驗選擇乙醇、甲醇和70%甲醇溶液作為對乙酰氨基酚提取溶劑進(jìn)行考察。

由試驗結(jié)果可知，在凝膠類化妝品中，甲醇和乙醇提取效率無明顯差異，70%甲醇溶液提取率較低；在膏霜類化妝品中甲醇提取效率最高，乙醇次之，70%甲醇溶液最低，且在實際操作中發(fā)現(xiàn)，對于膏霜類樣品，使用70%甲醇溶液為提取溶劑時，樣品過濾較為困難。考慮到不同基質(zhì)類化妝品提取效率的差異和上機后存在的溶劑效應(yīng)，選擇甲醇作為提取溶劑。

2.4 超聲提取時間的選擇

選用膏霜類和凝膠類兩批陽性樣品為待測對象，在相同條件下分別選取不同超聲時間（10、20、30 min）進(jìn)行測定。

試驗結(jié)果表明，對于膏霜類樣品，當(dāng)超聲提取10 min 后提取效果無明顯差異；對于凝膠類樣品，超聲提取時間對提取效果均無明顯差異?？紤]到產(chǎn)品基質(zhì)的差異，故選取20 min 作為該方法的提取時間。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取1.2 中制備的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定。以待測組分質(zhì)量濃度（x，μg／mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用線性回歸法計算相關(guān)系數(shù)。由結(jié)果可知，對乙酰氨基酚的質(zhì)量濃度在10～400 μg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

對對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋并檢測，按照3 倍的信噪比計算檢出限，得到對乙酰氨基酚的檢出濃度為0.01 μg／mL，則相應(yīng)檢出限為0.1 mg／kg。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表3。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.6 加標(biāo)回收率和精密度試驗

選取化妝水、乳液、凝膠、膏霜4 種空白基質(zhì)樣品，每種基質(zhì)分別添加4 個水平的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，每一個添加水平平行測定6 份，計算加標(biāo)回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。

由表4 可知，樣品加標(biāo)回收率為97.73%～101.00%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%～0.74%，表明所建立的分析方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。

表4 4 種空白基質(zhì)加標(biāo)回收率和精密度試驗結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗

為考察對乙酰氨基酚在整個實驗過程中（24 h內(nèi)）是否會降解或不穩(wěn)定等，從而導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈線性或樣品出現(xiàn)假陰性等不利狀況，對其進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。取1.2 中質(zhì)量濃度為50 μg／mL 的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在不同時間點進(jìn)行測定，測得的色譜峰面積由線性回歸方程計算得到實際測量濃度，并計算測定結(jié)果的相對偏差，結(jié)果見表5。由表5 可知，在24 h 內(nèi)對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度無太大差異，表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定性良好。

表5 對乙酰氨基酚24 h 內(nèi)穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.8 樣品測定

選取護膚、保濕類及嬰幼兒類產(chǎn)品包含乳液、膏霜、化妝水、凝膠等共48 批化妝品樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有兩批樣品檢出對乙酰氨基酚，檢出含量均為0.05%。兩批陽性樣品（某品牌修護凝膠和特護霜）使用說明均用于肌膚修護、滋養(yǎng)保濕及日常皮膚護理。為排除檢測過程中的人為污染因素，重新對這兩批同批號未開封樣品進(jìn)行檢測，并對樣品采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行確證，兩次檢測結(jié)果無明顯差異。因此，樣品中的對乙酰氨基酚非檢測過程中人為污染，均為生產(chǎn)帶入。

3 結(jié)語

建立了化妝品中對乙酰氨基酚含量的高效液相色譜檢測方法，并由液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對陽性樣品進(jìn)行確證。此方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于化妝品中對乙酰氨基酚的定量檢測和結(jié)果確證。