周加慧,宋作艷,謝春暉,陶 和,郭雨薇,牟傳琳,符 麗,林 旭,王 彬,畢燕琳*

0 引言

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙(Perioperative neruocognitive disorders,PND)是指麻醉手術(shù)后患者出現(xiàn)持續(xù)存在的記憶力、抽象思維和定向力障礙[1]，同時伴有社會活動能力變化的一種并發(fā)癥。明確其發(fā)病機制，可為有效預(yù)防PND的發(fā)生提供幫助。近年來有研究提出，microRNA在衰老與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生中有著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。有研究通過全基因組測序在晚發(fā)型阿爾茨海默病家族中也發(fā)現(xiàn)miRNA-320這一外顯變異基因[3]，并且在朊病毒感染所誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病小鼠海馬組織中發(fā)現(xiàn)miRNA-320異常表達[4]。而PND 在分子水平上與阿爾茨海默病同為神經(jīng)退行性疾病[5]，推測miRNA-320可能也是PND發(fā)病過程中的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。但目前關(guān)于miRNA-320與PND狀態(tài)的直接研究甚少。Antagomir是一種新型的人工化學(xué)合成物質(zhì)，根據(jù)miRNA的特異性核苷酸序列設(shè)計而成，可針對性地改變小鼠內(nèi)源性miRNA的表達[6]。本研究通過脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)方法建立小鼠PND模型，檢測應(yīng)用Antagomir-320后小鼠認(rèn)知功能發(fā)生的改變及海馬組織miRNA-320和相關(guān)蛋白IGF-1、APP表達變化，為治療及預(yù)防患者PND提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級C57/BL小鼠120只，12～14周齡，體重20～30 g，購于濟南朋悅實驗動物研究公司，許可證號：[SCXK(魯)20140007]，實驗開始前適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周，飼養(yǎng)于12 h黑白晝夜交替的恒定室溫及濕度的環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。采用隨機數(shù)字表法將其分為4組(n=30)：對照組(C組)、麻醉手術(shù)組(AS組)、生理鹽水+麻醉手術(shù)組(NS組)、Antagomir-320+麻醉手術(shù)組(AT組)。小鼠術(shù)前連續(xù)6 d均在同一時間段行Morris水迷宮訓(xùn)練，并在術(shù)前1 d進行曠場實驗，分別于術(shù)后1、3、7 d行曠場實驗并在行水迷宮測試結(jié)束后處死各組小鼠。

1.2 PND模型建立 參考文獻[7]行小鼠麻醉下單側(cè)下肢脛骨骨折切開復(fù)位髓內(nèi)針固定手術(shù)。將小鼠置于2 L/min的純氧攜帶5%異氟醚的小動物麻醉箱內(nèi)5 min進行麻醉誘導(dǎo)，將失去行動力的小鼠從麻醉箱內(nèi)取出，2.1%±0.5%異氟醚吸入以面罩方式維持麻醉狀態(tài)，分離脛骨平臺附近附著的筋膜與肌肉組織，充分暴露小鼠脛骨粗隆，將修剪后的0.38 mm針頭插入脛骨骨髓腔內(nèi)，使用手術(shù)刀與外科鉗于脛骨下1/3處人為造成骨折后，縫合傷口，消毒后局部涂抹復(fù)方利多卡因軟膏鎮(zhèn)痛。手術(shù)時間控制在15 min以內(nèi)。蘇醒后放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 海馬微量注射 在脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)模型建立前，按照50 mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予1%戊巴比妥鈉麻醉，在保證麻醉效果完善的前提下，固定小鼠頭部于立體定位儀平臺上，將小鼠頭部正中備皮消毒，給予利多卡因局部皮下注射，暴露顱骨，手術(shù)刀片剝離局部腦膜，定位零點于前囟，于鼠腦左右兩側(cè)旁開1.8 mm、沿矢狀軸向背側(cè)旁開2.5 mm、深度2.3 mm，海馬組織即定位于此并做好標(biāo)記。按照海馬深度將微量注射器針尖置于海馬內(nèi)，以0.2 μl/min速率將2 μl生理鹽水、Antagomir-320(0.5 nmol/μl)緩慢注入海馬內(nèi)，結(jié)束后將針留置5 min后，勻速緩慢拔出以防止藥物溢出。

1.4 Morris水迷宮 于術(shù)前 6 d開始每天于固定時間點進行Morris水迷宮訓(xùn)練,剔除有明顯運動障礙的小鼠。測試采用圓形水池,直徑 120 cm；圓柱形平臺直徑10 cm,高30 cm，隱匿平臺可放置于某一固定位置，于水面下0.5 cm。維持水溫恒定于(24±2)℃。術(shù)前1～5 d每天追蹤小鼠進行路徑采集。于第6天即術(shù)前1 d，撤除平臺，將小鼠隨機選擇某一落水點置入水池中，小鼠首次到達原平臺所在位置的時間則為術(shù)前逃避潛伏期。術(shù)后1、3、7 d 時采用相同的方法測定認(rèn)知功能。選用逃避潛伏期和靶象限停留時間百分比作為反映學(xué)習(xí)和記憶能力的指標(biāo)。

1.5 曠場試驗 曠場試驗檢測箱為白色正方體檢測箱，大小為 50 cm×50 cm×40 cm，箱內(nèi)有標(biāo)記線劃分為不同區(qū)域，放置在安靜環(huán)境中。將小鼠輕柔抓取，從曠場檢測箱一角緩慢放入，小鼠可以在箱內(nèi)自由運動，通過攝像頭記錄小鼠在檢測箱內(nèi)的運動路徑,記錄時間為 5 min。每個區(qū)域的小鼠測試結(jié)束后，將小鼠再次放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，對檢測箱側(cè)壁及底部使用75%酒精擦拭消毒，并充分晾干后進行下一輪測試。檢測期間保持安靜，減少外界環(huán)境對小鼠的任何刺激，選取小鼠自發(fā)運動的路徑為反映活動能力的指標(biāo)。

1.6 Western blot檢測海馬IGF-1、APP 術(shù)后1、3、7 d水迷宮測試結(jié)束后，隨機取5只小鼠斷頭處死，迅速切開顱頂皮膚,剝離頂骨、枕骨,取出小鼠腦組織置于冰臺上操作。根據(jù)解剖圖譜所示,取出小鼠海馬,放入凍存管保存在液氮中備用。處死后分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。取海馬組織加入RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物試劑研究所)，于冰面進行充分的研磨、裂解、離心，取上清液加入適量蛋白質(zhì)上樣緩沖液(5×)(碧云天生物試劑研究所)100 ℃加熱5 min，使用12%的聚丙烯凝膠(碧云天生物試劑研究所)電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)移到PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)上，使用5%脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司)在室溫搖床封閉3 h，使用TBST沖洗后，分別加入內(nèi)參抗體β-actin(稀釋1∶5 000,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，APP一抗(稀釋1∶1 000，Abcam公司,英國),IGF-1一抗(稀釋1∶5 000，Abcam公司,英國)，置于4 ℃低溫搖床下孵育過夜。TBST洗脫后加入二抗(稀釋度1∶6 000，北京中杉金橋科技公司)與膜在室溫搖床孵育2 h。使用ECL(碧云天生物試劑研究所)顯示結(jié)合蛋白，用生物成像系統(tǒng)進行分析。

1.7 qRT-PCR檢測海馬IGF-1 mRNA和miRNA-320表達 術(shù)后1、3、7 d水迷宮測試結(jié)束后，隨機取5只小鼠斷頭處死，迅速切開顱頂皮膚,剝離頂骨、枕骨,取出小鼠腦組織置于冰臺上操作。根據(jù)解剖圖譜所示，提取出小鼠海馬,將海馬組織置于RNA保存液(碧云天生物試劑研究所)中，4 ℃冰箱過夜，第2天棄去RNA保存液，將海馬組織放入-80 ℃冰箱保存。用超純RNA提取試劑盒(天根生化有限公司)提取海馬組織總RNA以及miRNA。使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化有限公司)將相應(yīng)RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑盒及miRcute 增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化有限公司)實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測得到的cDNA。GAPDH和U6作為內(nèi)部對照。引物序列:IGF-1上游：5′-ATGTTATCCGAAATAAGCTG-3′下游：5′-CTCTGCAAACCTCCATGCCG-3′；GAPDH上游：5′-CTGCAATCCGAAAGAAGCTG-3′下游；5′-ATC TTCA AACCTCCATGATG-3′；miRNA-320引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA-3′。U6引物；5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。結(jié)果顯示，在β-微管蛋白及U6正?；螅瑴y2-ΔΔCt的表達水平。擴增后立即測定溶出曲線，呈單峰，顯示出良好的產(chǎn)物特異性。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實驗 與C組相比，AS組、NS組、AT組在術(shù)后1、3、7 d逃避潛伏期延長、靶象限停留時間百分比降低(P<0.05)；與NS組相比，AT組術(shù)后3、7 d 潛伏期縮短、靶象限停留時間百分比增加(P<0.05)，而術(shù)后1 d與AS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AS與NS組相比，術(shù)后1、3、7 d逃避潛伏期和靶象限停留時間百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠各時點逃避潛伏期(s)與靶象限停留時間百分比的比較(%)

2.2 曠場實驗 術(shù)前各組小鼠的運動總路程差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與C組相比，在術(shù)后1、3、7 d，各組小鼠運動總路程差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 術(shù)后各時間點各組小鼠運動總路程的比較(cm)

2.3 小鼠術(shù)后海馬組織各時點IGF-1和APP的表達 與C組相比，AT組術(shù)后1 d IGF-1蛋白表達降低，術(shù)后3、7 d IGF-1蛋白表達升高；AS組與NS組海馬IGF-1略降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NS組相比，AT組術(shù)后1 d 表達降低，術(shù)后3、7 d表達升高(P<0.05)。與C組相比，AS組、NS組術(shù)后1、3、7 d以及AT組術(shù)后1、3 d APP蛋白表達均增加(P<0.05)，AT組術(shù)后7 d表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NS組相比，AT組術(shù)后3、7 d表達降低(P<0.05)，術(shù)后1 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NS組與AS組相比，術(shù)后1、3、7 d海馬IGF-1和APP的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠術(shù)后各時點海馬IGF-1和APP蛋白表達水平

2.4 小鼠術(shù)后海馬組織各時點IGF-1 mRNA和miRNA-320的表達 與C組相比，AS組、NS組術(shù)后1、3、7 d以及AT組術(shù)后1 d IGF-1mRNA表達均降低，AT組術(shù)后3 d和7 d表達升高(P<0.05)；與NS組相比，AT組術(shù)后1、3、7 d表達升高(P<0.05)；NS組與AS組相比，術(shù)后1、3、7 d差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與C組相比，AS組、NS組術(shù)后1、3 d miRNA-320表達升高(P<0.05)，術(shù)后7 d變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AT組術(shù)后1 d表達升高，術(shù)后3 d和7 d表達降低(P<0.05)；與NS相比，AT組在術(shù)后1、3、7 d表達均降低(P<0.05)；NS組與AS組相比，術(shù)后1、3、7 d差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠術(shù)后各時點海馬IGF-1 mRNA和miRNA-320的表達水平比較(n=5)

3 討論

微小核糖核酸(microRNA)是一類長度約20～30個核苷酸組成的高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與下游靶蛋白的3′-UTR結(jié)合，可降解mRNA或者阻止蛋白的翻譯而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用[8-9]。PND發(fā)病機制尚未明確，包括神經(jīng)炎癥、β淀粉樣蛋白沉積、tau磷酸化、膽堿能受損、突觸功能受損、缺乏神經(jīng)營養(yǎng)支持等。通常PND與精神神經(jīng)疾病密切相關(guān)，如與抑郁癥和阿爾茨海默病等有著共通的分子途經(jīng)[5]，而近年來越來越多的證據(jù)表明，失調(diào)的microRNA也參與了認(rèn)知功能障礙相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展，例如miRNA-320[4]、miRNA-572[10]、miRNA-126[11]、miRNA-31[12]、miRNA-34[13]等，而且miRNA作為具有生物活性的小分子物質(zhì),能夠自由穿過血-腦屏障，可能為中樞炎癥狀態(tài)和外周炎癥狀態(tài)的交流提供了信息傳遞的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。隨著對microRNA生物學(xué)領(lǐng)域的擴展，microRNA在發(fā)育和疾病中的作用認(rèn)知逐漸加深，使microRNA成為眾多疾病非常有吸引力的新型治療方法[15]。在該研究中，通過使用Antagomir-320作用于PND小鼠，可以看出miRNA-320與PND可能存在的關(guān)聯(lián)性，從而為PND治療提供新的方向。Zovoilis等[16]發(fā)現(xiàn)，相較于局部給藥，相同劑量的Antagomir全身給藥稀釋性降低該低聚物的活性濃度，因此，本實驗采用微量泵海馬局部注射以保證其作用的確切性，全身給藥的作用效應(yīng)仍需進一步驗證。

海馬是參與認(rèn)知功能的重要腦區(qū),與空間學(xué)習(xí)能力、記憶能力密切相關(guān)[17]。使用相對成熟的脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)建立實驗動物的PND模型[7]，通過經(jīng)典研究認(rèn)知功能的Morris水迷宮實驗檢測小鼠認(rèn)知功能，選取小鼠的逃避潛伏期及靶象限停留時間百分比作為反映學(xué)習(xí)能力與空間記憶能力的指標(biāo)，曠場實驗測試能排除脛骨骨折手術(shù)對小鼠活動能力產(chǎn)生影響，也是評價小鼠自主行為及探究行為的常用方法。有研究表明，異氟醚麻醉也是引起認(rèn)知障礙的因素之一[18]，但本實驗異氟醚暴露時間較短，因此，主要探究手術(shù)因素刺激所造成的PND。本研究結(jié)果顯示，相較于正常小鼠，手術(shù)組與麻醉手術(shù)組的小鼠逃避潛伏期延長，靶象限停留時間百分比降低，提示該實驗?zāi)Ｐ徒⒊晒Γ送?，手術(shù)組與麻醉手術(shù)組小鼠海馬組織的miRNA-320在術(shù)后1、3 d表達明顯升高。并且海馬注射這項操作對PND無明顯影響。

Liang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過Antagomir-320的局部腦室注射，可以改善腦缺血再灌注損傷，其可能機制是通過抑制小鼠缺血再灌注腦組織內(nèi)miRNA-320的表達，進而通過IGF-1途徑改善缺血再灌注損傷。IGF-1是調(diào)節(jié)神經(jīng)生長的重要物質(zhì)，能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和成熟，是細胞可塑性的有效神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)劑[20]。研究表明，IGF-1具有神經(jīng)保護功能[21]，此外，有研究發(fā)現(xiàn)，患有PND的患者外周循環(huán)中IGF-1的水平明顯低于正常組[22]。研究表明，IGF-1可以抑制APP、Aβ形成，從而促進神經(jīng)元的存活[23]，減緩認(rèn)知障礙的發(fā)生。而能與IGF-1mRNA靶向結(jié)合的miRNA-320[19,24]可引起 IGF-1mRNA 的降解或翻譯抑制,在轉(zhuǎn)錄后水平上負調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達，從而在學(xué)習(xí)與記憶方面發(fā)揮作用[25]。本實驗中，與正常小鼠相比較，麻醉手術(shù)組小鼠逃避潛伏期延長、靶象限停留時間百分比降低，miRNA-320在術(shù)后1、3 d表達明顯升高，IGF-1mRNA表達均降低，IGF-1蛋白有所降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，APP蛋白表達均升高。給予Antagomir-320處理后，與麻醉手術(shù)組相比較，逃避潛伏期縮短，靶象限停留時間百分比增高，miRNA-320表達降低，IGF-1mRNA及蛋白表達升高，APP于術(shù)后3、7 d 表達明顯降低。結(jié)合小鼠的行為學(xué)測試，以上結(jié)果支持Antagomir-320可能通過IGF-1通路影響了PND的發(fā)生與發(fā)展這一推測。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有豐富的microRNA表達，可參與神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)傳遞和突觸可塑等一系列生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，而Antagomir-320僅為miRNA-320的特異性抑制劑，手術(shù)病理刺激時，腦組織中大量的microRNAs是否通過參與其他生物學(xué)調(diào)節(jié)途徑，調(diào)控不同的認(rèn)知相關(guān)因子，從而參與圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙的發(fā)生與發(fā)展，仍需進一步探索。

綜上所述，Antagomir-320可能通過下調(diào)miRNA-320，進而調(diào)節(jié)認(rèn)知功能相關(guān)蛋白IGF-1、APP，改善脛骨骨折小鼠圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知功能，為PND的預(yù)防和治療提供了新的靶點。