高利興,王麗明,隋洪飛,韓立峰
(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300250;2.天津中醫(yī)藥大學(xué),組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617)
近年來(lái),隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大改變,高尿酸血癥作為一種代謝性疾病,其發(fā)病率持續(xù)升高,嚴(yán)重危害患者身體健康。高尿酸血癥是一種嘌呤代謝異常引起的疾病,是導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)病的主要誘導(dǎo)因素和直接病因,高尿酸血癥還可誘發(fā)中風(fēng)、糖尿病、冠心病和腦血管病、冠狀動(dòng)脈疾病、腎臟損傷等嚴(yán)重性疾病[1-3]。高尿酸血癥的特點(diǎn)是在正常嘌呤飲食狀態(tài)下,非同日兩次測(cè)空腹血尿酸水平男性為血清尿酸鹽大于70 mg/L,女性為大于60 mg/L[4]。高尿酸血癥的危害除了引發(fā)痛風(fēng)外[5-6],還可加重冠心病或高血壓病等病癥[7-8]。此外,長(zhǎng)期高尿酸血癥可破壞胰腺β細(xì)胞功能而誘發(fā)糖尿病[9]。大量尿酸長(zhǎng)期從腎小管通過(guò),形成尿酸結(jié)晶、結(jié)石沉積于腎臟,還會(huì)引發(fā)痛風(fēng)性腎病,腎功能損害,甚至尿毒癥[10-12]。
荷葉堿是荷葉中主要的阿樸啡型生物堿,為荷葉生物堿中主要活性成分[13-14]。近年來(lái),荷葉堿的藥理作用日益顯著,有文獻(xiàn)報(bào)道在小鼠高尿酸血癥模型中,荷葉堿的抗高尿酸和抗炎作用是通過(guò)調(diào)節(jié)腎有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和炎癥信號(hào)通路發(fā)揮作用,但是荷葉堿對(duì)生命體整體代謝網(wǎng)絡(luò)的影響仍有待進(jìn)一步研究[15]。
代謝組學(xué)是一種被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)、疾病診斷和毒理學(xué)等領(lǐng)域的系統(tǒng)研究方法[16-19]。代謝組學(xué)研究常用的樣本有尿液、血漿或血清、唾液、腦脊液等生物體液及細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)液和組織等,針對(duì)這些樣本的代謝產(chǎn)物研究可以反映機(jī)體健康狀態(tài)或疾病狀態(tài)下的重要信息。目前,代謝組學(xué)技術(shù)分析方法有許多,應(yīng)用最廣泛的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)及核磁共振法(NMR)[20]。NMR作為代謝組學(xué)的一個(gè)重要研究手段,具有分析全面、樣品制備簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好的特點(diǎn),而且可以同時(shí)提供代謝物定性、定量?jī)煞矫娴男畔21]。
本研究主要運(yùn)用核磁共振氫譜(1H-NMR)技術(shù),將荷葉堿對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸小鼠的血漿和尿液進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究,較為系統(tǒng)地分析氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型小鼠及荷葉堿治療后的代謝物水平變化,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析找出變化顯著的代謝物,揭示氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型動(dòng)物的潛在生物標(biāo)志物,同時(shí)為探討荷葉堿治療高尿酸血癥的作用機(jī)制提供參考。
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Bruker ASCEND 500 MHz超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司);3K15型高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);XW-80A型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);HSS型電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);電熱真空干燥箱(天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 重水(D2O,99.9%D)用于鎖場(chǎng)(劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室,美國(guó));2,2,3,3,-d4-3(三甲基硅基)丙酸鈉鹽(TSP),阿法埃莎化學(xué)有限公司]用于化學(xué)位移定標(biāo)及定量分析;超純水(優(yōu)級(jí),屈臣氏公司);磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,用于溶解灌胃樣品)。
1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司,純度大于98%;氧嗪酸鉀購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,純度大于98%。
1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明雄性小鼠24只,體質(zhì)量為(20±2)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。小鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室進(jìn)行為期1周的環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng),它們?cè)试S自由飲食及飲水,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房條件為:溫度:22~24℃,濕度:50%~65%的濕度,12 h光/暗周期。給藥前12 h禁食不禁水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,并經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(小鼠合格證號(hào):11400700389190)。
將荷葉堿和氧嗪酸鉀分別溶解在0.5%的羧甲基纖維素鈉混懸液中,根據(jù)前期研究,荷葉堿與氧嗪酸鉀的給藥劑量分別為25 mg/kg和200 mg/kg。
將小鼠按照每組8只隨機(jī)分為空白組、模型組和荷葉堿組。在本實(shí)驗(yàn)中,空白組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃;荷葉堿組先給予氧酸鉀灌胃,1 h后給予荷葉堿灌胃;模型組給予氧嗪酸鉀灌胃;均連續(xù)灌胃14 d。對(duì)于尿液樣品按照上述方法給藥后第13天將3組小鼠分別放入代謝籠過(guò)夜24 h,收集尿液,14 000 r/min,離心10 min,離心半徑10 cm,取上清液分裝存放-80℃冰箱,冷凍待用;血漿樣品在收集完尿樣后按照上述方法給藥后分別于2 h后眼眶靜脈叢取血,7 000 r/min離心10 min,離心半徑10 cm,取上清液,置于-80℃待測(cè)。
2.1 核磁實(shí)驗(yàn)方法
2.1.1 緩沖溶液的配制 0.045mol/LK2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的配制:按照K2HPO4∶NaH2PO4的質(zhì)量比為4∶1,加 10%D2O 和 0.6 mmol/L TSP 溶液溶解,用 pH計(jì)調(diào)節(jié)pH=7.4用于血漿樣品檢測(cè)。
2.1.2 1.5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的配制K2HPO4∶NaH2PO4=4∶1,加入 10%的 D2O 及 0.01%的TSP溶解,用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH=7.4,用于尿樣檢測(cè)。
2.1.3 待測(cè)樣品的配制 將尿液放在室溫下自然解凍,14 000 r/min離心10 min,離心半徑10 cm,取上清液,550 μL 尿液加入 55 μL 1.5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液,渦旋5 min,14 000 r/min離心5 min,離心半徑10 cm,取上清液550 μL至5 mm核磁管中分析。將血漿樣品放在室溫下自然解凍,渦旋 5 min,取 200 μL 血漿加入 400 μL 的 0.045 mol/L K2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液,渦旋 5min,14000r/min離心5min,取上清液550μL至5mm核磁管中分析。
2.1.4 NMR實(shí)驗(yàn)參數(shù) Bruker ASCEND 500 MHz采集1H-NMR譜,反相檢測(cè)探頭(BBI),采集溫度為298 K,noesypr1d脈沖序列。此序列采用預(yù)飽和方式壓制溶劑峰,從而抑制溶劑信號(hào)的檢測(cè)。循環(huán)時(shí)間(D1),混合時(shí)間(D8)以及 90°脈沖時(shí)間(P1)分別為 2s,0.2 s,12.91 μs,中心激發(fā)頻率(O1P)為 4.69 ppm,預(yù)飽和水峰壓制功率(PLW9)為23 dB。采樣點(diǎn)數(shù)為32k,譜寬(SW)為10,330Hz,掃描次數(shù)(NS)為160次。
2D NMR譜圖均采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列,其中包括COSY(1H-1H相關(guān)),HSQC,(1H-13C直接相關(guān))HMBC(1H-13C遠(yuǎn)程相關(guān)),TOCSY(1H-1H 全相關(guān)),J-RES(J-分辨光譜)。COSY脈沖序列為cosygpmfqf,梯度恢復(fù)時(shí)間(D16)為 0.2 μs,F(xiàn)1(1H)和 F2(1H)譜寬均為4 464.286 Hz,采樣點(diǎn)數(shù)陣為 t2×t1=2048×128,NS 為128次,2k數(shù)據(jù)點(diǎn)。HSQC的脈沖序列為hsqcetgpsi,其F1(13C)和 F2(1H)SW為 20831.980Hz和 4464.286Hz,弛豫時(shí)間為 1.457 811 s,采集時(shí)間為 0.118 834 s,采集數(shù)據(jù)點(diǎn)陣 t2×t1=1 024×256,NS 為 80 次,1 k 數(shù)據(jù)點(diǎn)。HMBC 的脈沖序列為 hmbcgpndqf,其 F1(13C)和F2(1H)SW 為 27 932.973 Hz 和 4 464.286 Hz,弛豫時(shí)間為 1.332 064 03 s,采集時(shí)間為 0.475 186 s,預(yù)掃描延遲時(shí)間為 6.50 μs,采集數(shù)據(jù)點(diǎn)陣 t2×t1=4 096×256,NS為160次,4k數(shù)據(jù)點(diǎn)。TOCSY脈沖序列為mlevphpp,其 F1(13C)和 F2(1H)SW 均為 4464.286Hz,弛豫時(shí)間為 1.898 965 s,采集時(shí)間為 0.237 618 s,D8為 0.08s,采集數(shù)據(jù)點(diǎn)陣 t2×t1=2048×256,NS為 100 次。J-RES的脈沖序列為jresqf,弛豫時(shí)間為2 s,采集時(shí)間為 0.102 450 s,F(xiàn)1 和 F2 維 SW 分別為 20.000 Hz和10 000.000 Hz,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣為 t2×t1=2 048×256,NS為32次,2 k數(shù)據(jù)點(diǎn)。
2.1.5 方法學(xué)考察 本實(shí)驗(yàn)主要以樣品某一特征峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移以及相對(duì)峰面積考察樣品的穩(wěn)定性及儀器的精密度。
穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):任意選取一個(gè)樣品放置2、4、8、10、12、18、24及36 h后檢測(cè)特征峰的化學(xué)位移和相對(duì)峰面積,分別計(jì)算RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)值。
精密度實(shí)驗(yàn):同一個(gè)樣品連續(xù)采集6次1HNMR譜圖,計(jì)算特征峰的化學(xué)位移和相對(duì)峰面積RSD值。
2.1.6 數(shù)據(jù)處理與分析1D NMR及2D NMR圖譜預(yù)處理使用Topspin(V3.5)軟件,包括指數(shù)窗函數(shù)變換、相位校正及基線矯正、化學(xué)位移漂移矯正(使用TSP)。多元統(tǒng)計(jì)分析用1H-NMR數(shù)據(jù)處理采用MestReNova 9.0.1 軟件,線寬因子設(shè)為 0.3 Hz,自由感應(yīng)衰變?yōu)榱闾畛涞?4 k數(shù)據(jù)點(diǎn)。除去TSP δ 0.00~0.02 ppm,水峰 δ 4.65~4.85 ppm。核磁共振光譜區(qū)以0.003 ppm 積分段對(duì)化學(xué)位移區(qū)間 δ 0.45~12.50 ppm進(jìn)行分段積分。積分所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,并轉(zhuǎn)換為二維矩陣,保存為 CSV 格式,使用 SIMCA-P+(v14.0)軟件進(jìn)行多變量分析,主要通過(guò)PCA(主成分分析)和OPLS-DA(正交偏最小二乘法判別分析)模型進(jìn)行分析。PCA模型主要看樣本間分組趨勢(shì)以及樣本組內(nèi)的離散程度;OPLS-DA模型主要得到得分散點(diǎn)圖和pearson圖。在得分散點(diǎn)圖中,每一個(gè)點(diǎn)代表不同的樣本,以樣本類別為變量(Y)建立一個(gè)PLS(最小二乘)模型,并獲得幾個(gè)與Y不相關(guān)的自變量(X)信息并將其替換,從而提高了模型識(shí)別能力。其中主要包括R2X,Q2兩個(gè)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),越接近于1,代表預(yù)測(cè)的結(jié)果真實(shí),模型可靠。在pearson圖中,核磁共振光譜區(qū)顏色越紅代表化合物差異越顯著,從而揭示了不同實(shí)驗(yàn)方法中的代謝物的顯著變化。將OPLS-DA模型所給出的每一個(gè)變量的VIP值中大于1的變量作為對(duì)模型分組貢獻(xiàn)最大,并將此數(shù)據(jù)導(dǎo)出,結(jié)合 t檢驗(yàn),篩選 VIP>1 且 P<0.05 的變量進(jìn)行分析。
將上述所得到的潛在差異代謝物的信息,通過(guò)2D NMR譜圖,數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Metabolome Database,https://hmdb.ca/)檢索,以及 Chenomx NMR Suite 軟件數(shù)據(jù)庫(kù)(Chenomx Inc.)等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
3.1 血漿尿酸檢測(cè)結(jié)果 將收集的血漿樣品室溫下自然解凍,渦旋5 min,混旋均勻,血漿中的尿酸水平用尿酸試劑盒進(jìn)行檢測(cè),所有血漿樣本均放于96孔板進(jìn)行檢測(cè),血漿尿酸的處理方法按照試劑盒使用說(shuō)明書所描述的方法在自動(dòng)生化分析儀(TECAN,瑞士)中測(cè)量,2h后結(jié)果空白組是(132.70±4.30)μmol/L、模型組是(188.14±4.81)μmol/L、荷葉堿組是(130.46±4.70)μmol/L,模型組與空白組相比(P<0.01),荷葉堿組與模型組相比(P<0.01),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.2 核磁實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.2.1 方法學(xué)考察 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)特征峰的化學(xué)位移RSD值及相對(duì)峰面積RSD值如表1所示,結(jié)果表明樣品36 h內(nèi)穩(wěn)定。精密度實(shí)驗(yàn)血樣和尿樣的特征峰的化學(xué)位移RSD值和相對(duì)峰面積RSD值均小于5%,說(shuō)明儀器測(cè)量精密度良好。
表1 基于1H-NMR樣品中特征峰的精密度及穩(wěn)定性Tab.1 The precision and stability of characteristic peaks in1H-NMR samples %
3.2.2 基于1H-NMR荷葉堿血漿和尿液樣品的指紋圖譜 荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液的核磁共振圖譜如圖1和2所示。其中 δ 0.05~4.00 ppm 為氨基酸及有機(jī)酸區(qū),δ 4.00~5.50 ppm 為碳水化合物區(qū),δ 5.50~8.70 ppm為芳香區(qū)。代謝產(chǎn)物的鑒定主要是基于文獻(xiàn),在線數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)以及Chenomx軟件,并結(jié)合2D NMR圖譜進(jìn)行分析,共篩選出50個(gè)化合物。
圖1 空白組、模型組和荷葉堿組小鼠尿液樣品的1H-NMR譜圖Fig.1 1H-NMR spectra of mice urine samples in blank control group,model group and nuciferine treatment group
圖2 空白組、模型組和荷葉堿組小鼠血漿樣品的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of mice plasma samples in blank control group,model group and nuciferine treatment group
3.2.3 主成分分析 將荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液在1H-NMR采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析,1H-NMR數(shù)據(jù)采樣模式下PCA的R2X和Q2值見表2。
表2 基于1H-NMR尿樣和血漿樣品的PCA參數(shù)值Tab.2 PCA parameter values based on1H-NMR urine and plasma samples
將血漿樣品和尿樣采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析,制作PCA分析的得分圖,如圖3所示。在無(wú)監(jiān)督模式的PCA分析下分組不太明顯,無(wú)法明顯區(qū)分不同組間的差異。然后利用有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘-判別分析進(jìn)行分組比較分析。
圖3 基于1H-NMR譜的尿液(A)和血漿(B)PCA分析得分圖Fig.3 PCA scores plot of urine(A)and plasma(B)based on1H-NMR spectra
3.2.4 正交偏最小二乘法-判別分析 為進(jìn)一步尋找給藥前后荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液的影響,本實(shí)驗(yàn)采用OPLS-DA統(tǒng)計(jì)分析模型,用來(lái)尋找差異性化學(xué)成分,并利用得分圖和載荷圖表示,1H-NMR數(shù)據(jù)采樣模式下OPLS-DA的不同分組和樣品的模型結(jié)果參數(shù)見表3,尿液和血漿樣品的得分圖及載荷圖見圖4。
表3 基于1H-NMR尿樣和血漿的OPLS-DA參數(shù)值Tab.3 OPLS-DA parameter values based on1H-NMR urine and plasma samples
3.2.5 基于1H-NMR的差異化合物結(jié)果 通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,選擇VIP>1的化合物作為篩選荷葉堿作用于氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠的血漿和尿液含量差異較大的化學(xué)成分,并根據(jù)候選差異化學(xué)成分在1H-NMR數(shù)據(jù)中的相對(duì)峰面積進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,P<0.05的數(shù)據(jù)可認(rèn)為是潛在生物標(biāo)志物,在血漿和尿液樣品中共找到9個(gè)潛在生物標(biāo)志物,9個(gè)生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)如表4所示。
圖4 基于1H-NMR譜的尿液(A)和血漿(B)OPLS-DA得分圖和載荷圖Fig.4 OPLS-DA score plots and loading plots based on1HNMR spectrum of urine(A)and plasma(B)
表4 基于1H-NMR的潛在生物標(biāo)志物Tab.4 Potential biomarkers from1H-NMR spectra
3.3 差異代謝物的通路分析 通過(guò)1H-NMR技術(shù)在血漿和尿液樣品中共篩選出9個(gè)潛在生物標(biāo)志物,為了進(jìn)一步揭示這些差異代謝物之間的相關(guān)性,應(yīng)用 metaboanalyst網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行代謝通路富集分析,其中這9個(gè)潛在生物標(biāo)志物均可以被數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG,https://www.kegg.jp/)識(shí)別,涉及到多條代謝通路,結(jié)果如圖5所示,這些差異物主要涉及到酪氨酸代謝、檸檬酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及糖酵解和糖異生。
圖5 高尿酸血癥相關(guān)代謝通路圖Fig.5 Metabolic map of hyperuricemia-related pathways
實(shí)驗(yàn)采用了核磁共振氫譜技術(shù)對(duì)正常對(duì)照小鼠、氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥模型小鼠,及荷葉堿給藥治療組小鼠的血漿、尿樣進(jìn)行了分析,實(shí)驗(yàn)分別考察了zgpr、cpmgpr1d及noesypr1d等脈沖序列,以及NS分別為64、160、200時(shí)的信號(hào)采集情況,同時(shí)考察了壓水峰的功率PLW9分別為20、23、30、35 dB時(shí)的信號(hào)采集情況,結(jié)果表明,noesypr1d采集譜圖信號(hào)較好,而且隨著掃描次數(shù)的增加,血漿樣品中特征峰的峰強(qiáng)度相應(yīng)增強(qiáng),但采樣時(shí)間也相應(yīng)增加,根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度的變化并考慮實(shí)驗(yàn)時(shí)間等因素,最終選擇采樣次數(shù)為160次,通過(guò)調(diào)節(jié)預(yù)飽和壓水峰的功率可以看出,當(dāng)功率為23 dB時(shí)水峰的強(qiáng)度相對(duì)較小,對(duì)其他峰的影響也較小,樣品的特征峰具有較強(qiáng)的峰強(qiáng)度和分辨率。
代謝物鑒定一般采用同核化學(xué)位移相關(guān)譜(COSY),異核單量子相關(guān)譜(HSQC),異核多鍵相關(guān)譜(HMBC),全相關(guān)譜(TOCSY)等常規(guī)二維譜,JRES為一種通過(guò)J調(diào)制的自旋回波將化學(xué)位移與J耦合分開,從而使一維氫譜上重疊在一起的譜峰分散在平面上,是對(duì)擁擠譜峰指認(rèn)的有效方法。本實(shí)驗(yàn)綜合了各種二維譜及J-RES譜,實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜譜峰的解析,為后續(xù)代謝通路分析提供數(shù)據(jù)支持。
本實(shí)驗(yàn)闡明高尿酸血癥涉及的9個(gè)潛在生物標(biāo)志物,它們涉及酪氨酸代謝、檸檬酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及糖酵解和糖異生等多個(gè)途徑。
精氨酸和脯氨酸代謝途徑:肌酐是肌酸的中間代謝產(chǎn)物,是骨骼肌的能量?jī)?chǔ)備,通常在腎功能受損時(shí)觀察到[22]。甜菜堿廣泛分布于動(dòng)物,植物和微生物中,也是動(dòng)物膽堿氧化的代謝產(chǎn)物,甜菜堿是肌酐下游的代謝產(chǎn)物[23]。在模型組中,肌酐、肌酸、甜菜堿的含量升高,說(shuō)明腎功能遭到破壞;而荷葉堿治療組又恢復(fù)到正常水平,表明高尿酸血癥干擾了精氨酸和脯氨酸代謝途徑,荷葉堿具有較好的治療效果。
酪氨酸代謝途徑:酪氨酸是生酮生糖氨基酸,苯丙氨酸4-單加氧酶(PAH基因編碼蛋白)是關(guān)鍵酶,PAH蛋白功能可以催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸,同時(shí),苯丙氨酸在芳香族L-氨基酸脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)化為苯乙胺,模型組中酪氨酸含量降低,而荷葉堿組的含量升高至正常水平,說(shuō)明高尿酸血癥使酪氨酸代謝發(fā)生紊亂。
檸檬酸代謝途徑:檸檬酸是三羧酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物,主要存在于線粒體中,是能量代謝的中心。檸檬酸裂解酶是檸檬酸轉(zhuǎn)化為醋酸鹽的關(guān)鍵酶,檸檬酸含量降低,醋酸鹽含量升高可能是檸檬酸酶被激活,使檸檬酸加速轉(zhuǎn)化為醋酸鹽。琥珀酸鹽是三羧酸(TCA)循環(huán)的重要中間體,位于代謝途徑的十字路口。在線粒體中,它在產(chǎn)生三磷酸腺苷中起關(guān)鍵作用,在模型組中琥珀酸的含量降低,而荷葉堿組又恢復(fù)到正常水平,提示高尿酸血癥使能量代謝發(fā)生異常,而荷葉堿能夠糾正這種異常。
糖酵解和糖異生途徑:丙酮酸是糖代謝中具有關(guān)鍵作用的中間產(chǎn)物。它可以通過(guò)乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化,為機(jī)體提供能量。與BC相比,丙酮酸的含量在模型組中增加,表明體內(nèi)的能量代謝發(fā)生紊亂。
由于實(shí)驗(yàn)采用核磁共振氫譜法進(jìn)行檢測(cè),該方法雖然通用,但也存在一定的不足,比如高尿酸血癥典型特征為尿酸的升高,而尿酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)為7,9-二氫-2,6,8(3H)三酮-1H-嘌呤,該化合物含有4個(gè)氫,均為活潑氫,在核磁共振譜上未出現(xiàn)信號(hào),最終導(dǎo)致該化合物未被檢出,這提示1H-NMR代謝組學(xué)應(yīng)與其他代謝組學(xué)技術(shù)(如LC-MS、GC-MS代謝組)相結(jié)合,取長(zhǎng)補(bǔ)短,最終更加全面的反應(yīng)生命體代謝特征。
荷葉具有升發(fā)清陽(yáng),涼血止血的功效,臨床上主要用于治療用于暑熱煩渴,暑濕泄瀉,脾虛泄瀉,血熱吐衄,便血崩漏等癥。最近研究表明其主要成分荷葉堿具有顯著降尿酸效果,但關(guān)于其藥效的核磁代謝組學(xué)研究卻鮮有報(bào)道。本研究首先建立基于核磁共振氫譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法,分別優(yōu)化了脈沖序列,采樣掃描次數(shù),預(yù)飽和壓水峰脈沖功率等參數(shù),最終確定最佳數(shù)據(jù)采集方法。在此基礎(chǔ)上,本研究對(duì)小鼠的血漿和尿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究,較為系統(tǒng)地分析了氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型小鼠的代謝特征,同時(shí)比較了經(jīng)荷葉堿治療后的代謝物變化差異,綜合運(yùn)用主成分分析及偏最小二乘法判別分析等多元統(tǒng)計(jì)分析方法,挖掘模型組與正常組及給藥組與模型組之間變化顯著的差異代謝物。在化合物的鑒定方面,本研究主要采用COSY、HSQC、HMBC、TOCSY等多種核磁二維譜技術(shù),以及J-分辨譜,最終成功鑒定了50個(gè)化合物。多元統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:從各組別中共篩選出與高尿酸血癥代謝通路密切相關(guān)的9個(gè)潛在生物標(biāo)志物,分別為:丙酮酸、乙酸、酪氨酸、肌酸酐、乙酰乙酸、肌酸、檸檬酸、琥珀酸,以及甜菜堿。對(duì)這些代謝物進(jìn)行進(jìn)一步的通路富集分析說(shuō)明了高尿酸血癥的病理過(guò)程主要涉及到酪氨酸代謝、檸檬酸代謝、精氨酸與脯氨酸代謝以及糖酵解和糖異生代謝途徑,預(yù)示著這些潛在生物標(biāo)志物不僅在早期疾病診斷中起重要作用,而且在預(yù)防高尿酸血癥中也有重大意義。