余麗穎，詹欣雨，曾思羽，陳明付，高 歡，陳瓊霞，陳 瑩，鎮(zhèn)鴻燕

（江漢大學 醫(yī)學院，湖北 武漢 430056）

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是一群具有自我更新能力和分化潛能的細胞，可導致多種惡性腫瘤生物學行為，如復發(fā)、轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性、多藥耐藥、放療耐藥等［1］。腫瘤干細胞標記物對于腫瘤診斷、治療及預后判斷具有重要意義。

2018 年國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer）發(fā)布全球癌癥發(fā)病率和死亡率評估值表明，乳腺癌在全球女性癌癥發(fā)生率和死亡率均位居首位［2］，是嚴重危害女性健康的疾病。2003 年Al－Hajj 等［3］研究發(fā)現(xiàn)CD44＋CD－/lowLineage－標記的乳腺癌細胞具有干細胞的特性，是最早被鑒定出來的乳腺癌干細胞。乳腺癌干細胞被認為是許多乳腺癌患者復發(fā)及轉(zhuǎn)移的“元兇”，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥與腫瘤干細胞密切相關，影響乳腺癌患者的生存及預后，一些相關腫瘤標記物可以用于乳腺癌靶向性治療及預后判斷［4－7］。

乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）是乙醛脫氫酶家族成員之一，是一種解毒酶，負責將視黃醇氧化為視黃酸［8］。研究［9－13］表明，ALDH1 是結腸癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等多種腫瘤干細胞標記物。2007 年，Ginestier 等首次鑒定ALDH1 是乳腺癌的干細胞標志物［14］。該研究表明ALDH1 蛋白表達陽性的乳腺癌細胞表現(xiàn)出腫瘤干細胞的特性，具有成瘤性。但目前ALDH1 在乳腺癌免疫組化定位研究及臨床病理相關性研究國內(nèi)相關報道較少，尚待進一步開展。

本研究擬采用免疫組織化學方法檢測ALDH1 蛋白在乳腺癌及癌旁組織中的定位及表達情況，并結合臨床病理資料分析ALDH1 與乳腺癌T 分期腫瘤最大直徑、腫瘤分級及淋巴結轉(zhuǎn)移的關系，以期對乳腺癌的診斷和預后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2008－2013 年江大病理診斷所確診為乳腺癌的病例71 例，全部病例手術前均未進行放療和化療。全部病例均為女性病人，年齡27 ～88 歲，中位年齡58 歲。腋窩淋巴結清掃病例48例，其中淋巴結轉(zhuǎn)移38 例。組織學分級：I 級4 例，II 級49 例，III 級18 例。根據(jù)腫瘤T 分期將腫瘤分成：T1 ～T2 期即腫瘤最大直徑為0 ～5 cm 54 例，T3 期即腫瘤最大直徑≥5 cm 17 例。71例腫瘤患者中癌旁組織29 例。所有標本均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋。由有經(jīng)驗的病理醫(yī)生進行HE 病理切片的復查和篩選，在HE 切片中標記并選取典型的乳腺癌組織及其癌旁組織，取直徑1 mm 的組織芯制成組織微陣列芯片。

1.2 免疫組織化學檢測

鼠抗人單克隆ALDH1 為美國BD 公司產(chǎn)品，Envision 試劑盒為丹麥Dako 公司產(chǎn)品，ALDH1一抗工作濃度1∶100。組織切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復煮沸10 min。染色方法采用Envision 二步法，用PBS 代替一抗作為陰性對照。一抗孵育4 ℃過夜。

1.3 ALDH1 免疫組化染色結果判定

細胞質(zhì)或細胞核著色，呈現(xiàn)明確的棕黃色顆粒，且定位準確、背景清晰。參照許良中等［15］免疫組化評分標準首先按染色強度打分：0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色（染色深淺須與背景對照）；再按陽性細胞所占的百分比打分：0 分為陰性，1 分為陽性細胞數(shù)≤10%，2 分為陽性細胞數(shù)為11% ～50%，3 分為陽性細胞數(shù)為51% ～75%，4 分為陽性細胞數(shù)為≥75%。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3 分為免疫反應（＋），0 ～2 分為陰性。

1.4 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學處理采用SPSS20 軟件進行數(shù)據(jù)分析，腫瘤T 分期（腫瘤最大徑）、腫瘤分級及淋巴結轉(zhuǎn)移組間陽性率差異用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ALDH1 在乳腺癌及癌旁組織中表達情況

29 例乳腺癌癌旁導管組織中，ALDH1 表達主要呈核表達。癌旁正常乳腺導管組織，ALDH1表達主要定位導管肌上皮細胞內(nèi)呈散在分布，少許定位在導管上皮內(nèi)呈散在分布（圖1）；癌旁組織部分導管中見乳腺導管上皮增生，在增生上皮內(nèi)見ALDH1 陽性表達細胞（圖2）；71 例乳腺癌中，ALDH1 表達主要定位于細胞漿中，部分癌組織呈散在表達（圖3），部分癌組織呈彌漫表達，表達細胞呈星芒狀結構（圖4）。

圖1 正常乳腺導管中ALDH1 表達（Envision 法20×）Fig.1 Expression of ALDH1 in normal mammary ducts（Envision 20×）

圖2 乳腺增生導管中ALDH1 表達（Envision 法20×）Fig.2 Expression of ALDH1 in the duct of mammary hyperplasia（Envision 20×）

圖3 乳腺癌中ALDH1 散在表達（Envision 法40×）Fig.3 Scattered expression of ALDH1 in breast cancer（Envision 40×）

圖4 乳腺癌中ALDH1 彌漫表達（Envision 法40×）Fig.4 Diffused expression of ALDH1 in breast cancer（Envision 40×）

2.2 ALDH1 在乳腺癌中的表達與臨床病理特征的關系

71 例乳腺癌中ALDH1 陽性表達32 例，陽性率45.1%。T1 ～T2 期54 例腫瘤中ALDH1 表達陽性28 例，陽性率51.9%；T3 期腫瘤17 例中ALDH1 表達陽性4 例，陽性率23.5%。組織學分級I 級腫瘤4 例中ALDH1 表達陽性3 例，陽性率75.0%；II 級腫瘤49 例中ALDH1 表達陽性19例，陽性率38.8%；III 級腫瘤18 例中ALDH1 表達陽性10 例，陽性率55.6%。腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移腫瘤38 例中ALDH1 表達陽性16 例，陽性率42.1%；腋窩淋巴結無轉(zhuǎn)移腫瘤10 例中ALDH1 表達陽性3 例，陽性率30.0%。ALDH1 表達與乳腺癌患者T 分期、腫瘤分級及淋巴結轉(zhuǎn)移統(tǒng)計學無顯著相關關系（P＞0.05）（表1）。

表1 ALDH1 的表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系（n＝71）Tab.1 Relationship between ALDH1 expression and clinicopathological parameters of breast cancer（n＝71）

3 討論

研究［16］表明，腫瘤干細胞與腫瘤發(fā)生、異質(zhì)化及轉(zhuǎn)移密切相關。1994 年，Dick 團隊成功鑒定人急性髓系白血病細胞成瘤細胞是CD34＋CD38－細胞［17］，首次證明腫瘤干細胞存在。Al－Hajj等［3］2003 年從乳腺癌中分離具有干細胞特性的CD44＋/CD24－/low細胞表型的細胞，并證實乳腺癌中存在一種具有成瘤能力的腫瘤干細胞，即乳腺癌癥干細胞。目前，研究證明，乳腺癌的腫瘤干細胞標記物有許多種，如CD133、CD44、CD24、ALDH1 等，其中ALDH1 是非常重要的腫瘤干細胞標記物。

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）家族中共包括了17 種同工酶，廣泛分布于多種組織中，能夠催化多種醛的氧化［18］。哺乳動物乙醛脫氫酶根據(jù)其亞細胞所在位置、結構與動力學特性和原始序列的相似性可以分為三類：第一類是細胞質(zhì)的乙醛脫氫酶（ALDHl）；第二類是線粒體的乙醛脫氫酶（ALDH2）；第三類則是可誘導性的細胞質(zhì)的乙醛脫氫酶和可誘導性的微粒體的乙醛脫氫酶（ALDH3）［19］。

乙醛脫氫酶1（ALDH1）能有效促使短鏈脂肪族醛和芳香族醛的氧化，是一種催化一系列脂肪族和芳香族醛氧化成相應的羧酸的酶，它幾乎存在于所有哺乳動物組織。人類ALDH1 基因位于9 號染色體，由5.3 × 104個堿基對構成，包含13 個外顯子，共編碼501 個氨基酸［20］。ALDH1是一種含鋅酶類，由兩個亞基組成，其中一個位于酶的活性中心，另一個起著穩(wěn)定四級結構的作用。ALDH1 具有高度氧化活性，在氧化視黃醇為視黃酸的過程中參與基因的表達和細胞增殖、分化。因此，探討ALDH1 蛋白表達定位及臨床病理關系，有助于了解乳腺癌干細胞在乳腺癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為乳腺癌患者治療提供潛在靶點。

Ginestier 等［14］對577 份乳腺癌患者癌組織標本行免疫組化檢測研究，發(fā)現(xiàn)高表達ALDH1 的乳腺癌細胞具有干細胞特性，并與乳腺癌患者生存期有顯著相關性。

本研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1 在乳腺癌中的表達率為45.1%，與Mansour 等［16］的研究結果41.7%接近。圖1 ～圖3 顯示，乳腺癌組織同良性乳腺組織相比，陽性細胞數(shù)量明顯增多，證明了乳腺癌癌癥干細胞含量增多，乙醛脫氫酶在乳腺癌干細胞中活性明顯升高。因此，在乳腺癌與乳腺良性病變中，ALDH1 的陽性表達定位差異可以作為判斷腫瘤良惡性的輔助標記。

此外，乳腺癌旁組織中，ALDH1 主要表達在細胞核中，而乳腺癌組織中則主要表達在細胞質(zhì)中，這說明在腫瘤的發(fā)生中，ALDH1 出現(xiàn)了從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。乙醛脫氫酶是一類存在于細胞質(zhì)的酶類。ALDH1 核表達可能是其沉默狀態(tài)，當腫瘤干細胞被激活，處于活躍增殖狀態(tài)時，ALDH1 則進入細胞質(zhì)內(nèi)行使其功能。因此，ALDH1 可能是腫瘤干細胞生長活躍的標志，這有待進一步研究。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)，不同T 分期腫瘤ALDH1 的表達率不同，其中T1 ～T2 期腫瘤ALDH1 表達率51.9%，T3 期為23.5%，前者ALDH1 陽性率明顯高于后者。該研究結果提示腫塊較小的腫瘤中可能存在相對比例較高的ALDH1 陽性腫瘤干細胞，因此，小體積腫瘤具有生長迅速的潛能。

Armstrong 等［21］的研究表明ALDH1 通過參與視黃醇的氧化過程參與基因的表達和組織分化，是造血干細胞分化的關鍵調(diào)節(jié)因子。本研究結果表明，組織學分級I 級及III 級ALDH1 陽性率分別為75.0%、55.6%，前者明顯高于后者。同時，圖1 與圖3 顯示在良性組織中ALDH1 陽性細胞呈核表達，癌組織中呈星芒狀，因此，提示在ALDH1 陽性乳腺癌細胞在腫瘤形成中出現(xiàn)了上皮間質(zhì)化改變，從而在形態(tài)學角度上證明ALDH1 蛋白表達參與腫瘤細胞分化過程，并證明ALDH1 陽性乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞特性。該研究結果與Vieira 等［22］2020 年在頭頸癌中的研究結果一致。

另外，本研究結果表明，在淋巴結轉(zhuǎn)移清掃病例中，淋巴結轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移乳腺癌中ALDH1陽性率分別為42.1%及30.0%，淋巴結轉(zhuǎn)移乳腺癌ALDH1 陽性表達呈升高趨勢。本研究結果與周飛等［9］2020 年研究結果一致。提示ALDH1 蛋白陽性乳腺癌具有較強侵襲性，與乳腺癌的不良預后密切相關。

綜上，本研究結果表明ALDH1 在乳腺癌中表達與腫瘤活躍生長密切相關，同時也與腫瘤形成上皮間質(zhì)化相關。提示ALDH1 有可能參與腫瘤增殖、分化及轉(zhuǎn)移過程，與乳腺癌的生存及預后密切相關。ALDH1 陽性表達有望成為腫瘤診斷及治療的靶點。