楊 光

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。近年來，宮頸癌確診患者的年齡有年輕化的趨勢，其組織學(xué)類型也明顯增加［1－2］。因此，宮頸癌的臨床及術(shù)后治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)。有研究［3］表明中醫(yī)藥聯(lián)合治療對宮頸癌術(shù)后治療起減毒增效的作用。熊果酸（ursolic acid，UA）是一種純天然化合物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抗突變和抗血管生成、改變腫瘤微環(huán)境等作用［4］，為一種極具潛力的新型抗腫瘤藥物［5－6］。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸對宮頸癌HeLa 細(xì)胞有顯著增殖抑制效率，且促腫瘤細(xì)胞凋亡；體內(nèi)荷瘤鼠抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熊果酸能明顯抑制腫瘤生長，延長荷瘤鼠生存周期，改善其生存狀況［7］。但目前熊果酸治療宮頸癌的分子作用機(jī)制研究尚顯匱乏，本研究通過生物信息學(xué)及分子對接術(shù)進(jìn)一步探索熊果酸作用于宮頸癌的作用機(jī)制及其靶點(diǎn)，為臨床研究提供依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將小分子化合物與系統(tǒng)生物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)結(jié)合起來，采用生物信息學(xué)方法構(gòu)建“藥物－靶點(diǎn)－疾病”的靶標(biāo)預(yù)測模型，能夠系統(tǒng)闡述藥物與疾病的作用機(jī)制［8］。因此，本研究使用生物信息學(xué)、GEO 差異基因分析及分子對接術(shù)對熊果酸治療宮頸癌的作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)闡述，探索其發(fā)揮藥效的可能途徑。

1 方法

1.1 藥物疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［9－10］和Drug-Bank 數(shù)據(jù)庫查詢熊果酸對疾病的作用靶點(diǎn)，并對靶點(diǎn)信息進(jìn)行整理優(yōu)化，得到化合物相應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因名稱。通過uniprot.org下載活性成分－疾病靶點(diǎn)基因的GeneSymbol對應(yīng)的UniProt_ID 號。

1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測及差異基因的篩選

分別運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫及NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下GEO 數(shù)據(jù)庫，以“cervical cancer”為關(guān)鍵詞，檢索與宮頸癌相關(guān)的基因，同時，以“Homo sapiens”及“Expression profliling by array”為篩選條件，下載GSE63514 基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，獲取與宮頸癌相關(guān)的基因并導(dǎo)出結(jié)果。將熊果酸有效成分的疾病作用靶點(diǎn)與宮頸癌相關(guān)靶點(diǎn)相互映射，得到熊果酸抗宮頸癌的作用靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將靶點(diǎn)基因信息輸入Cytoscape3.8.0 軟件，利用BisoGenet 插件創(chuàng)建靶點(diǎn)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；用CytoNCA 插件對所得的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治?。首先篩選大于2 倍中位數(shù)的度中心性值Degree（DC）的節(jié)點(diǎn)，再進(jìn)行介度中心性Betweenness（BC）篩選［11］，依據(jù)Degree 值大小對關(guān)鍵基因進(jìn)行排序，得到熊果酸治療宮頸癌的核心PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO 生物功能注釋及KEGG 通路分析

在R 語言中安裝及調(diào)用生物類程序包，如stringi、colorspace、clusterProfiler，BiocManager 等對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 及GO 富集分析。依據(jù)基因富集數(shù)目與顯著度（P＜0.05）篩選與腫瘤相關(guān)的排名前10 的GO 生物功能繪制柱狀圖；運(yùn)用Cytoscape3.8.0 構(gòu)建“通路－靶點(diǎn)基因”的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 通路圖繪制

依托KEGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp//），選擇PathwayMapping 中的Search&Color Pathway，將熊果酸抗宮頸癌的靶點(diǎn)導(dǎo)入，將上調(diào)基因標(biāo)記為“red”，下調(diào)基因標(biāo)記為“blue”，optional use of outside ID 選擇uniprot，獲取熊果酸作用于宮頸癌的通路圖，選擇與腫瘤密切相關(guān)的pathway in cancer 通路，繪制通路圖。

1.6 熊果酸與核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證

本研究將蛋白質(zhì)大分子與小分子配體進(jìn)行對接，通過能量高低來判斷其結(jié)合程度，一般情況下，活性小分子與蛋白質(zhì)大分子靶點(diǎn)的結(jié)合能（binding energy）和形成氫鍵數(shù)是衡量結(jié)合能力的重要指標(biāo)，結(jié)合能越低則親和力越強(qiáng)、氫鍵數(shù)越多結(jié)合越穩(wěn)定。首先，從PDB 數(shù)據(jù)庫（rcsb.org/）中搜索熊果酸作用于宮頸癌的核心靶點(diǎn)的三維立體結(jié)構(gòu)；再從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載熊果酸的小分子配體2D 結(jié)構(gòu)，通過Chem3D 軟件轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)。利用AutoDockTools 對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行去水、加氫、加電荷等預(yù)處理后分別與熊果酸進(jìn)行分子對接；最后，用PyMOL 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)預(yù)測

通過TCMSP 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫查找收集熊果酸基本信息及與疾病相關(guān)的預(yù)測靶點(diǎn)，剔除無效靶點(diǎn)后得到55 個熊果酸的有效靶點(diǎn)。通過GeneCards 及GEO 數(shù)據(jù)庫共篩選出2 905 個與宮頸癌相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將熊果酸的有效靶點(diǎn)與宮頸癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集進(jìn)行映射，最終篩選出39個可能與熊果酸治療宮頸癌相關(guān)的作用靶點(diǎn)，繪制韋恩圖如圖1 所示。

圖1 熊果酸與宮頸癌潛在靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of potential targets of ursolic acid and cervical cancer

2.2 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

構(gòu)建39 個疾病靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，能產(chǎn)生相互作用的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)共有2 396 個，邊47 669 條。所得PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 軟件，使用CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y(jié)果見圖2。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)共得到RELA、JUN、CDKN1A、ICAM1、STAT3、NFKBIA、MAPK8 等主要候選基因共15 個，按自由度大小進(jìn)行排序，詳見表1。

圖2 蛋白互作PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Topological network of protein interaction PPI

表1 熊果酸治療宮頸癌的核心靶點(diǎn)Tab.1 The core targets of ursolic acid in the treatment of cervical cancer

2.3 基因功能及通路

將熊果酸與宮頸癌相交集的39 個靶基因利用R 語言進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析。GO 分析共得到1 171 條通路，其中生物學(xué)過程（BP）占1 092 條，分子生物學(xué)功能（MF）占57 條，細(xì)胞組分（CC）占22 條。與腫瘤相關(guān)的BP 有regulation of apoptotic signaling pathway（15 個靶點(diǎn)）、extrinsic apoptotic signaling pathway（13 個靶點(diǎn)）、negative regulation of apoptotic signaling pathway（13 個靶點(diǎn)）等，GO 分析的柱狀圖見圖3、圖4 和圖5（縱坐標(biāo)表示通路名稱，橫坐標(biāo)表示富集基因的數(shù)量，P.adjust 代表富集基因的顯著性）。

圖4 熊果酸治療宮頸癌的基因分子功能MF 圖Fig.4 Molecular function (MF) of ursolic acid in the treatment of cervical cancer

圖5 熊果酸治療宮頸癌的基因細(xì)胞成分CC 圖Fig.5 Cellular component (CC) of ursolic acid in the treatment of cervical cancer

構(gòu)建KEGG 分析結(jié)果共得到172 條通路，將這些通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)數(shù)排前20 的“通路－關(guān)鍵靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖6，排名前10 的通路信息見表2。熊果酸治療宮頸癌的信號通路主要包括pathways in cancer（26 個靶點(diǎn)）、TNF signaling pathway（16 個靶點(diǎn)）、PI3K－Akt signaling pathway（16 個靶點(diǎn)）、apoptosis（15 個靶點(diǎn)）、IL－17 signaling pathway（14 個靶點(diǎn)）、small cell lung cancer（12 個靶點(diǎn)）等。如圖6 所示，外圈紅色V 形圖標(biāo)代表熊果酸針對宮頸癌所涉及的信號通路，中間黃色方形圖標(biāo)為靶基因，其圖標(biāo)的大小與所參與基因和通路的多少相關(guān)，黑色邊線代表靶標(biāo)－通路之間的關(guān)聯(lián)，直觀地展示了熊果酸抗宮頸癌多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。所涉及的核心基因有RELA、JUN、CDKN1A、NFKBIA、MAPK8、CCND1、CASP3、CASP8、FOS、BCL2、BAX、CDK4 及VEGFA 等，與PPI 網(wǎng)絡(luò)的主要預(yù)測基因基本一致。

圖6 KEGG 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 KEGG pathway and gene network

表2 KEGG 主要通路富集結(jié)果Tab.2 Enrichment results of KEGG main pathways

2.4 靶點(diǎn)KEGG 通路圖

運(yùn)用KEGG Mapper 獲得熊果酸抗宮頸癌的pathways in cancer 信號通路圖（見圖7），紅色圖標(biāo)表示上調(diào)基因，藍(lán)色圖標(biāo)表示下調(diào)基因。共涉及26 個熊果酸抗宮頸癌的有效靶點(diǎn)，占熊果酸與宮頸癌相交集的39 個靶點(diǎn)的67%。預(yù)示熊果酸抗宮頸癌的靶點(diǎn)分散于這條通路中，主要通過調(diào)節(jié)以下幾個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用：持續(xù)的血管再生（sustained angiogenesis）、回避凋亡（evading apoptosis）、增殖（proliferation）及基因組不穩(wěn)定性（genomic instability）等。

圖7 熊果酸治療宮頸癌的靶點(diǎn)在腫瘤通路中的富集分析Fig.7 Pathways in cancer of ursolic acid targets in the treatment of cervical cancer

2.5 分子對接驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)的預(yù)測能力，本研究采用分子對接術(shù)探討熊果酸治療宮頸癌的可能性。利用Autodock4 軟件，選取蛋白PPI 互作網(wǎng)絡(luò)圖中Degree 值排名前6 的靶標(biāo)（RELA、JUN、CDKN1A、ICAM1、STAT3、NFKBIA）與熊果酸進(jìn)行分子對接。從分子對接結(jié)果來看（見圖8），RELA、JUN、CDKN1A、ICAM1、STAT3、NFKBIA 與熊果酸分子的結(jié)合自由能及（氫鍵數(shù)）分別為：－4.83（1）、－4.95（2）、－4.95（1）、－5.38（2）、－4.71（1）、－5.96（1）。以上對接均存在氫鍵，且結(jié)合自由能均為負(fù)值，說明熊果酸與宮頸癌的核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力。

圖8 熊果酸與疾病靶點(diǎn)分子對接示意圖Fig. 8 Docking schematic diagram of ursolic acid with disease targets

3 討論

3.1 靶點(diǎn)確定及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

本研究通過TCMSP 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫搜集熊果酸對疾病的潛在作用靶點(diǎn)，與從Gene-Cards 及GEO 數(shù)據(jù)庫獲取的宮頸癌靶點(diǎn)相映射，共得到39 個熊果酸作用于宮頸癌的靶點(diǎn)。利用BisoGenet 及CytoNCA 插件構(gòu)建核心PPI 網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測RELA、JUN、CDKN1A、ICAM1、STAT3、NFKBIA、MAPK8 等15 個核心靶點(diǎn)。

NF－κB 是細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程中最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，幾乎所有的細(xì)胞類型均存在，這些信號傳導(dǎo)是由大量生物學(xué)過程，如炎癥、免疫、細(xì)胞生長、腫瘤發(fā)生和凋亡等啟動，RELA 作為其重要的亞基參與NF－κB 復(fù)合體DNA 的結(jié)合，直接激活轉(zhuǎn)錄因子的活性，還可調(diào)節(jié)啟動子對轉(zhuǎn)錄因子的可及性，從而間接調(diào)控基因的表達(dá)。有研究［12］證實(shí)RELA 在參與宮頸病變由HPV 感染到腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。Lai 等［13］通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶基因檢測發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，JUN 在宮頸腫瘤中呈上調(diào)趨勢。李文娟等［14］發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Fos 及JUN 蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)JAK－STAT 信號傳導(dǎo)通路活性有關(guān)。CDKN1A 參與p53/TP53 介導(dǎo)的對DNA 損傷的細(xì)胞增殖抑制，結(jié)合并抑制周期蛋白依賴的激酶活性，在阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程方面起著重要作用。miR－93/CDKN1A 軸在宮頸癌細(xì)胞惡變中發(fā)揮重要作用，CDKN1A 的下調(diào)可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和患者的預(yù)后有關(guān)，可作為宮頸癌的治療靶點(diǎn)［15］。STAT3 是STAT 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，參與細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育等多種生理過程。研究［16］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過滅活Tyr705 磷酸化的STAT3 來抑制STAT3 信號通路，從而對子宮頸癌細(xì)胞起增殖抑制作用。NFKBIA 是NF－κB 抑制劑α，即編碼的IκB－α 基因，能產(chǎn)生新的IκB－α 蛋白，可從細(xì)胞核中清除來終止NF－κB 的信號傳導(dǎo)［17］。有研究［18］發(fā)現(xiàn)，死亡受體途徑介導(dǎo)了Hela 細(xì)胞的凋亡，在此途徑中TNF 激活下游的NF－κB 通路，使NFKBIA過度表達(dá)，NFKBIA 參與了Hela 細(xì)胞凋亡并介導(dǎo)p53 基因的失活。

3.2 通路分析

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示熊果酸作用于宮頸癌的靶點(diǎn)主要涉及pathways in cancer、TNF signaling pathway、PI3K－Akt signaling pathway、apoptosis 等信號通路。宮頸癌進(jìn)展分為四個階段：一期宮頸癌癌細(xì)胞僅發(fā)生在子宮頸上皮區(qū)域，屬于原位癌；二期宮頸癌腫瘤慢慢增大，超過子宮；三期宮頸癌癌細(xì)胞一般會侵犯到盆腔、陰道；四期宮頸癌屬于晚期，可轉(zhuǎn)移至直腸和膀胱。Yi 等［19］通過全面的生物信息學(xué)分析，認(rèn)為PI3K－Akt signaling pathway 和proteoglycans in cancer 與II 期宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)；同時，兩個常見的癌癥相關(guān)信號通路pathways in cancer和proteoglycans in cancer 在III 期中富集，而70 個通路在宮頸癌IV 期顯著富集，如pathways in cancer、TNF signaling pathway、PI3K－Akt signaling pathway、small cell lung cancer 等。除了常見的癌癥相關(guān)信號通路，IL－17 signaling pathway、VEGF signaling pathway 和endocrine resistance 也被證明與宮頸癌進(jìn)展相關(guān)。熊果酸能通過PI3K－Akt signaling pathway 抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［20］。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析，結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，獲取熊果酸與宮頸癌的潛在分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并通過分子對接術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過對靶點(diǎn)和通路的分析預(yù)示熊果酸抗宮頸癌主要通過調(diào)節(jié)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗血管再生及抗炎等作用而產(chǎn)生多靶點(diǎn)、多通路的作用來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的目的。