遲 明，劉 霞，李光英，毛海峰，劉 洋

（1.青海省輕工業(yè)研究所，青海西寧 810001；2.天津科技大學，天津 300457）

隨著科學技術與經(jīng)濟社會的發(fā)展，快速的工作節(jié)奏和超負荷的工作，處在亞健康狀態(tài)的群體漸漸增加[1]。世界性癌癥研究原始數(shù)據(jù)調(diào)查報告顯示，現(xiàn)如今世界上處在健康狀態(tài)的人不足5%，處在患病的非健康狀態(tài)的群體小于20%，高達75%的群體處在亞健康狀態(tài)[2]。許多歐美國家早已將亞健康與艾滋病并列，稱其為21世紀影響人類健康最大的因素。大量研究說明，人體的各種亞健康狀態(tài)應由神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌的自我調(diào)控機制來改變[3]。因此，如何改善機體的免疫能力、改變亞健康狀態(tài)成為了研究的熱點課題。

中藥成分是古代我國瑰寶，中藥主要成分中的多糖和其他活性物質(zhì)可以通過提高吞噬機體的功能，增加了機體淋巴系統(tǒng)的機能，提高了機體的白細胞介素和干擾水平，提高了機體的免疫力。刺五加在中國古代醫(yī)藥理論中作為一種重要的藥物廣泛使用已有悠久的文化和歷史，具有“補中益精、堅筋骨、強志意”的重要作用，《本草綱目》中有明確的說法，刺五加在中華民族中帶有“補中益氣，堅筋骨，弱意志，久服輕身耐老”的重要效用[4]。刺五加還包括了心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、自我反應和生理系統(tǒng)、免疫活動調(diào)控、抗癌、保護肝臟、防止衰老、抵御氧化、防治炎癥、抗應激等活性，已在臨床中廣泛應用[5]。

枸杞是我國藥食兩用的傳統(tǒng)名貴中藥材，有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種功能[6-7]。刺五加、枸杞都具有提高機體免疫功能的作用，但兩者配伍使用相關研究未見報道。因而，通過研討刺五加枸杞配伍的膠囊對于大鼠免疫基本功能的影響，明確不同劑量刺五加枸杞配伍的膠囊對于人體免疫基本功能的影響，為刺五加及枸杞新商品的開發(fā)提供參與。

1 材料與方法

1.1 材料

刺五加枸杞膠囊，陜西秦巴山區(qū)天然中草藥研究開發(fā)中心有限公司提供，由刺五加、枸杞等為原料制成，人體推薦量2.1 g/d，折合刺五加生藥3.0 g/d，枸杞生藥3.6 g/d。

1.2 試驗動物

第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供試驗的研究小鼠，SPF級雄性昆明種小鼠，體重18～22 g。

200只雌性小鼠，每組40只小鼠被隨機劃分為4個小組。分別設計0.35 g/kg·BW（低劑量組），0.70 g/kg·BW（中劑量組），1.05 g/kg·BW（高劑量組3個用藥量組和陽性對照組，蒸餾水組視為該次試驗的陽性對照組。各組動物按照劑量每天灌胃1次，容量是20 mL/kg·BW，陰性對照組灌入等量蒸餾水，持續(xù)灌胃30 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗（MTT法）[8]

小鼠經(jīng)口灌服刺五加枸杞膠囊及去離子水30 d后處死小鼠，在無菌前提下取脾胃并放到無菌Hank's液平皿中，磨碎之后做成細胞培養(yǎng)液。過濾后用Hank's液洗2次，以轉速1 000 r/min離心10 min，計數(shù)活細胞數(shù)（95%）以上，調(diào)節(jié)細胞濃度至3×106個/mL。每一份脾細胞膜培養(yǎng)液均設置2個套管（1 mL/孔），一孔內(nèi)再加ConA液75 μL（份額為7.5 μg/mL），一組安放于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中展開72 h的培養(yǎng)。在培養(yǎng)完畢之后的4 h，小心吸去各個孔0.7 mL的上清液，接著引入RPMI1640懸液0.7 mL（不含小牛血清），同時在每個孔中加入50 μL的MMT（5 mg/mL），4 h后再每個孔中加入1 mL的酸性異丙醇，混合均勻后測定其在波長570 nm的OD值。

1.3.2 二硝基氟苯（DNFB）誘導小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應 （DTH）[9]

樣品小鼠在第26天時腹腔注射，注射2%（V/V）SRBC（0.2 mL/只）進行致敏，于免疫后第4天每鼠左右足跖部皮下注射20%（V/V） SRBC（20 μL/只）進行攻擊，并與攻擊前和攻擊后的24 h分別測量每只小鼠的足跖同一部位的厚度值。計算厚度差值，進行方差分析。

1.3.3 血清溶血素的測定[10]

選取羊血，使用生理鹽水洗滌羊血3次，每次洗滌過后以轉速2 000 r/min離心10 min。小鼠盆腔注射0.2 mL、2%（V/V） 的細胞培養(yǎng)液。免疫后的4～5 d摘眼球采血、分離血清。稀釋血漿倍比使用鹽水，微量血凝板內(nèi)每一孔引入100 μL的不同稀釋度的血漿，而后再引入100 μL的0.5%（V/V） SRBC培養(yǎng)液，倒入濕潤的平盤內(nèi)后在37℃的溫箱中孵育3 h前展開血漿溶血素測定。

1.3.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗（半體內(nèi)法）[11]

小鼠經(jīng)口灌服低聚肽蜂花硒粉和蒸餾水30 d后，小鼠/組進行腹腔注射雞紅細胞懸液（1 mL，20%（V/V），頸椎脫臼處死小鼠，每一只小鼠經(jīng)腹腔注入2 mL的生理鹽水，接下來轉動1 min鼠板，然后將吸出的腹腔洗液（1 mL） 平均分開，滴在2片玻片上，將其擺放到墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，37℃的前提下溫育30 min。孵畢后使用生理鹽水將其進行漂洗、晾干。去離子水漂洗擦拭之后展開鏡檢，在油鏡之下計量100個巨噬細胞，計算吞噬率、吞噬指數(shù)。

1.3.5 小鼠碳廓清試驗[12]

大鼠末次給藥完畢后1 h，展開尾靜脈的注射（印度墨汁10 mL/kg·BW：鹽水3.5倍稀釋），注射墨汁后2，10 min分別內(nèi)眥靜脈叢采血20 μL，迅速加入到碳酸鈉溶液（0.1%，2 mL） 中混合均勻。對照為碳酸鈉溶液，于波長600 nm處測定OD值。取處死前大鼠的肝臟和脾臟，使用濾紙拭干器官表層的血污，而后分別稱質(zhì)量并記錄計算結果。計算吞噬指數(shù)（a），如果受試試樣組的吞噬指數(shù)明顯低于對照組，亦可判定結果為陰性。

1.3.6 抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）[13]

取脫纖維羊血，選用蒸餾水洗濯3次脫纖維羊血，每天洗濯之后也以轉速2 000 r/min離心10 min，每次僅小鼠經(jīng)胸腔注射0.2 mL的2%（V/V） SRBC。SRBC自己免疫4 d之后小鼠處死之后拔出其脾臟，放到一個盛裝難的具有Hank's液的小平皿中，小心地磨碎其脾臟，做成一種細胞培養(yǎng)液，過濾前以轉速1 000 r/min離心10 min，用Hank's液洗2遍，之后將其細胞核性懸浮于RPMI1640菌液5 mL中，計數(shù)到細胞，并將細胞的濃度調(diào)整到5×106個/mL。

空斑的測定：將培養(yǎng)基（1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL） 的表面層加熱溶解以后，放置到45～50℃進行水浴保溫，與等量的pH值7.2～7.4，2倍含量的Hank's液混合之后再展開分裝，每個管0.5mL，管內(nèi)應該引入50 μL，10%（V/V） 的SRBC（選用SA溶液制備而是變成），20 μL的5×106個/mL脾細胞膜培養(yǎng)液，快速混勻前將其傾倒于刷了瓊脂糖薄層的玻片之上展開平行試驗，瓊脂凝結前置于片架上固定。再擺放到CO2培養(yǎng)箱展開1.5 h的孵育，接下來再將份額為1∶8的SA緩沖液稀釋補體引入玻片架的凹槽內(nèi)，繼續(xù)展開1.5 h的育溫。記錄溶血空斑的數(shù)目。不同用量組的結果應當與陽性對照組比較展開方差分析。

1.3.7 NK細胞活性測定[14]

試驗前24 h需要進行靶細胞的傳代培養(yǎng)。使用前用Hank's液洗3次，調(diào)整細胞膜pH值為4×105個/mL。取脾制成單細胞懸液。過濾后用Hank's液洗2次，每次清洗后都以轉速1 000 r/min離心10 min。將細胞膜漿彈起，而后加入0.5 mL清洗空氣（20 s），血小板裂解前再加入2倍的0.5 mL Hank's液和8 mL Hank's液，以轉速1 000 r/min離心10 min，而后選用富含10%小牛血漿的RPMI1640完全培養(yǎng)基（1 mL） 重懸，溶解之后計量（活細胞核數(shù)應當在95%以上），再用臺盼藍染色記錄活細胞數(shù)（應在95%以上），最后調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL，調(diào)整細胞濃度使用RPMI1640完全培養(yǎng)液。

分別取10 μL的靶細胞及效應細胞膜引入到U型的96孔培養(yǎng)板中：靶細胞自然開釋孔分別加100 μL的靶細胞和菌液，加10 μL靶細胞最大開釋孔加靶細胞和1% NP40；各項設置3個平行孔做平行試驗，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔培養(yǎng)板以轉速1 500 r/min離心5 min，每一孔汲取上清100 μL安放到平底的96孔培養(yǎng)板中；另一方面引入100 μL的LDH基質(zhì)液，反應時間為8 min，在每一孔中引入1 mol/L的HCl溶液30 μL，于波長490 nm處測定OD數(shù)值。計算NK細胞核活性，如果各個劑量組結果明顯低于陽性對照組判別結果陰性。

2 結果與分析

2.1 刺五加枸杞膠囊劑量小鼠體重的影響

不同劑量刺五加枸杞膠囊在遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）、小鼠測定及胰腺臟器/體重乘積測定及碳化廓清試驗、ConA誘導的小鼠脾胃淋巴細胞轉化試驗及NK細胞核活性測定、抗原生成細胞核測試及血漿溶血素測定及小鼠胸腔巨噬細胞吞噬羊血小板試驗的5組試驗中，體重都沒有明顯區(qū)別。由此可見，劑量對小鼠體重的作用效果較小。

圖1 各劑量組刺五加枸杞膠囊對試驗一組小鼠體重的影響（±s）

2.2 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠淋巴器官/比重比值的影響

各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠淋巴器官/比重比值的影響 （±s） 見表1。

表1 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠淋巴器官/比重比值的影響 （±s）

表1 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠淋巴器官/比重比值的影響 （±s）

組別 劑量/g·（k g·B W）-1動物數(shù)/只胸腺/體重/×1 0-3 p值 脾臟/體重/×1 0-3 p 值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.0 5 0.7 0 0.3 5 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0.3 3 2±0.0 4 0 0.3 2 7±0.0 5 4 0.3 0 8±0.0 4 3 0.3 1 9±0.0 6 2 0.9 9 9 0.9 9 3 0.7 1 3-0.4 2 3±0.0 2 8 0.4 2 5±0.0 5 3 0.3 9 5±0.0 4 3 0.4 0 6±0.0 5 0 1.0 0 0 0.9 9 3 0.4 4 1-

由表1可知，高劑量組和中劑量組試驗小鼠的胸腺/比重比值和脾臟/體重均略高于對照組，說明一定劑量的添加，可以促進小鼠的生長，能夠?qū)π∈蟮纳眢w狀況形成影響。相對來說，低劑量組的實驗小鼠胸腺/比重比值和脾臟/體重略低于對照組但是沒有太大的差別，可能是由于劑量較低，還沒有能對小鼠的內(nèi)部關于淋巴器官的細胞形成影響時就已經(jīng)被分解，從而幾乎沒有影響。總的來說，不同劑量的五加枸杞膠囊對小鼠的淋巴器官和體重的影響整體相對較小。

2.3 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠脾淋巴細胞轉化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

各劑量組刺五加枸杞膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響（±s） 見表 2。

由表2可知，處理組呈現(xiàn)隨著刺五加枸杞膠囊劑量的增加，ConA誘導的脾淋巴細胞增殖OD差值逐漸增大的趨勢，說明刺五加枸杞膠囊劑量越高，越能加強脾淋巴細胞增殖，但是也可以看到，試驗數(shù)據(jù)變化不明顯，可能是由于本身ConA誘導受刺五加枸杞膠囊劑量外來刺激的變化較小，使自身的誘導基本上不受影響。另外，足跖厚度差值的試驗數(shù)據(jù)看出，隨著刺五加枸杞膠囊劑量的增加，試驗小鼠的足跖厚度差值逐漸增加。其中，中、高劑量的刺五加枸杞膠囊試驗組增長幅度較大，與對照組差別較為明顯，說明較高的刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠的足跖厚度影響較大。

表2 各劑量組刺五加枸杞膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響（±s）

表2 各劑量組刺五加枸杞膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響（±s）

組別 劑量/g·（kg·BW）-1動物數(shù)/只ConA誘導的脾淋巴細胞增殖OD差值p值 足跖厚度差值/mm p值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 0.113±0.016 0.111±0.011 0.104±0.010 0.099±0.010 0.029 0.061 0.621-0.737±0.085 0.694±0.035 0.651±0.087 0.648±0.071 0.025 0.362 0.999-

2.4 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠血清溶血素水平的影響

表3 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠血清溶血素水平的影響（±s）

表3 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠血清溶血素水平的影響（±s）

組別 劑量/g·（kg·BW）-1動物數(shù)/只血清溶血素（抗體積數(shù)） p值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 181.60±10.63 179.60±10.67 168.70±16.17 166.80±7.85 0.021 0.051 0.969-

由表3可知，刺五加枸杞膠囊劑量的不同處理組呈現(xiàn)隨著劑量的升高小鼠體內(nèi)血清溶血素（抗體積數(shù)）逐漸增加的趨勢。其中，刺五加枸杞膠囊低劑量處理與陰性對照組相比變化較小，然而，由試驗數(shù)據(jù)可以看到，刺五加枸杞膠囊低中劑量和高劑量處理組中，試驗小鼠的抗體積數(shù)增長幅度變大，且顯著高于陰性對照組，數(shù)據(jù)說明，刺五加枸杞膠囊劑量的增加能夠有效提升小鼠的血清溶血素水平，其中高劑量刺五加枸杞膠囊的使用效果最佳?？梢圆聹y，隨著劑量的再次增加，其抗體積數(shù)可能還會增加，但是同樣也可能帶來一定的副作用。

2.5 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響（±s） 見表4。

由表4可知，不同劑量刺五加枸杞膠囊的處理隨著劑量的升高，小鼠體腹腔巨噬細胞吞噬百分率逐漸增加的趨勢。其中，刺五加枸杞膠囊的低劑量處理組與陰性對照組比較來說差異較小，說明低劑量的刺五加枸杞膠囊處理對小鼠的作用較小，然而試驗數(shù)據(jù)表明，刺五加枸杞膠囊的中高劑量處理組對小鼠的腹腔的巨噬細胞的吞噬能力具有明顯的促進作用，吞噬指數(shù)遠高于陰性對照組，說明刺五加枸杞膠囊劑量的增加是對小鼠腹腔的巨噬細胞吞噬能力有積極的影響效果。

表4 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響（±s）

表4 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響（±s）

組別 劑量/g·（kg·BW）-1動物數(shù)/只吞噬百分率/% p值 吞噬指數(shù) p值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 42.58±3.35 40.33±2.42 38.40±2.63 38.50±3.36 0.011 0.386 0.988-0.907±0.076 0.838±0.100 0.780±0.110 0.759±0.098 0.005 0.186 0.818-

2.6 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠碳廓清功能的影響

表5 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠碳廓清功能的影響（±s）

表5 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠碳廓清功能的影響（±s）

組別 劑量/g·（kg·BW）-1動物數(shù)/只 吞噬指數(shù)a p值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 5.363±0.670 5.291±0.347 5.106±0.529 4.701±0.491 0.021 0.043 0.227-

由表5可知，不同劑量刺五加枸杞膠囊對小鼠碳廓清功能作用效果都顯著高于陰性對照組，并且呈現(xiàn)隨著刺五加枸杞膠囊劑量的增加，試驗小鼠的吞噬指數(shù)a逐漸增加的趨勢，試驗數(shù)據(jù)表明低、高、中劑量組相對于陰性對照來說，都能顯著提高小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)a，說明其中刺五加枸杞膠囊對小鼠的碳廓清功能這一方面具有明顯的增強作用，可以有效提升吞噬指數(shù)a，刺五加枸杞膠囊的高劑量處理組對試驗小鼠的作用效果最為明顯。

2.7 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠抗體生成細胞功能的影響

表6 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠抗體生成細胞功能的影響 （±s）

表6 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠抗體生成細胞功能的影響 （±s）

組別 劑量/g·（kg·BW）-1動物數(shù)/只溶血空斑數(shù)（個/106脾細胞） p值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 974.00±127.04 943.00±92.62 877.00±96.50 824.00±102.00 0.008 0.042 0.544-

由表6可知，不同劑量的刺五加枸杞膠囊處理組對試驗小鼠抗體生成細胞功能作用效果都顯著高于陰性對照組，且呈現(xiàn)隨著刺五加枸杞膠囊處理劑量的增加，試驗小鼠的溶血空斑數(shù)（個/106脾細胞）逐漸增加的趨勢，試驗數(shù)據(jù)說明刺五加枸杞膠囊處理組促進了小鼠體內(nèi)抗體生成細胞數(shù)量的增加，差異性顯著（p＜0.01，p＜0.05）。其中，中、高劑量的刺五加枸杞膠囊處理組顯著高于陰性對照組的溶血空斑數(shù)，說明了這2個處理組對小鼠體內(nèi)抗體生成細胞功能具有明顯促進作用，且高劑量組的刺五加枸杞膠囊使用效果最佳。

2.8 刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠NK細胞活性的影響

表7 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠NK細胞活性的影響（±s）

表7 各劑量組刺五加枸杞膠囊對小鼠NK細胞活性的影響（±s）

組別 劑量/g·（kg·BW）-1動物數(shù)/只NK細胞活性/% p值高劑量組中劑量組低劑量組陰性對照組1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 41.75±3.76 41.38±3.97 40.04±3.18 40.52±3.22 0.665 0.845 0.967-

由表7可知，雖然試驗組整體呈現(xiàn)隨著刺五加枸杞膠囊劑量的增加，其NK細胞活性隨之增大的趨勢，但是對比陰性對照組來說，刺五加枸杞膠囊劑量對小鼠NK細胞的活性影響不大。其中，中、高劑量的刺五加枸杞膠囊處理對小鼠NK細胞活性具有一定的促進作用，但效果不顯著，反而可以看到低劑量的刺五加枸杞膠囊處理對小鼠NK細胞活性相對于陰性對照組活性還有所降低。說明刺五加枸杞膠囊本身對小鼠NK細胞活性影響不大，不調(diào)控NK細胞的活性。

3 結論

免疫能力降低是亞健康群體的主要體現(xiàn)方法，主要是由于人們緊張的、不規(guī)律的生活狀態(tài)所致。隨著人們對品質(zhì)生活追求的不斷提高，對自身的身體健康狀態(tài)也越來越重視，為了有效改善身體的亞健康狀態(tài)，許多人選擇服用保健品提高自身免疫力[15-16]。針對現(xiàn)代人群亞健康狀態(tài)及免疫力降下降的問題，以刺五加、枸杞為主要原料，開發(fā)了增強機體免疫力的刺五加枸杞膠囊，并對小鼠進行一系列提高免疫力的試驗。

結果表明，各劑量組小鼠各期體重、小鼠胸腺/比重比值和脾臟/體重比值及小鼠NK細胞活性無明顯變化。與對照組相比較來說，高用藥量組能夠顯著提升ConA誘導的大鼠脾胃淋巴細胞轉化能力、抗原積數(shù)、吞噬率及吞噬指數(shù)；高用藥量組以SRBC攻擊后大鼠組足跖間距比值比吸收劑對照組顯著變大，差異顯著（p＜0.05）。與對照組比較，高、中用藥量組能顯著提高大鼠碳廓清吞噬指數(shù)、抗原生成生物體數(shù)目，差異顯著（p＜0.05）。試驗數(shù)據(jù)表明，綜合整體來看，隨著刺五加枸杞膠囊劑量的增加，試驗結果均呈現(xiàn)較好的趨勢，且高劑量刺五加枸杞膠囊的處理組相對于陰性對照組來說，作用效果尤為明顯，且使用效果最佳。

按照《保健食品檢驗與技術評價規(guī)范》 （2003）版能判斷，該類商品對細胞膜免疫功能測定和機體免疫功能測定結果均為陽性，該類商品有著提高免疫能力的效用。試驗結果顯示，由枸杞、沙棘配伍的產(chǎn)品不良反應較少，不會破壞機體正常的免疫功能，安全性高且效果好，可為后續(xù)刺五加枸杞的產(chǎn)品開發(fā)及廣泛應用提供有力的佐證。目前，對于刺五加、枸杞提高免疫力方面機制及作用研究都較少，還需進行大量試驗。因此，可加強對這2種中藥的基礎研究，為其進一步臨床應用及資源開發(fā)提供科學依據(jù)。