周磊 艾望 陳小娟 聞春月

中圖分類號 R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）24-3000-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.10

摘 要 目的：研究蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。方法：將HK-2細(xì)胞分為正常組、高糖組、厄貝沙坦組（陽性對照，1 μmol/L）和蘿卜硫素低、中、高濃度組（10、20、40 μmol/L），正常組細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，其余各組細(xì)胞均用高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含40 mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，再加入相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)48 h。檢測各組細(xì)胞的存活率、凋亡率以及細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（Bax）mRNA和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）蛋白的表達(dá)量。另將HK-2細(xì)胞分為正常組、高糖組、蘿卜硫素高濃度組（40 μmol/L）、阿卡地新組（AMPK激動劑，1 mmol/L）、蘿卜硫素高濃度+compound C組（蘿卜硫素40 μmol/L+AMPK抑制劑compound C 40 μmol/L）、哌立福辛組（Akt抑制劑，19.95 μmol/L）、蘿卜硫素高濃度+SC79組（蘿卜硫素40 μmol/L+Akt激動劑SC79 4 μmol/L），同法培養(yǎng)后，檢測細(xì)胞中p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：與正常組比較，高糖組細(xì)胞的存活率以及細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2 mRNA和p-AMPK蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），凋亡率以及細(xì)胞中caspase-3、Bax mRNA和p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。與高糖組比較，蘿卜硫素低、中、高濃度組和厄貝沙坦組細(xì)胞上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05），其中蘿卜硫素中、高濃度組細(xì)胞上述指標(biāo)的改善效果均顯著優(yōu)于蘿卜硫素低濃度組（P<0.05）。與厄貝沙坦組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與蘿卜硫素高濃度組比較，阿卡地新組細(xì)胞中p-AMPK、p-mTOR蛋白和哌立福辛組細(xì)胞中p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;蘿卜硫素高濃度+compound C組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），p-mTOR蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.05）;蘿卜硫素高濃度+SC79組細(xì)胞中p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：蘿卜硫素可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)p-AMPK表達(dá)，下調(diào)p-mTOR、p-Akt、p-PI3K表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 蘿卜硫素;高糖;人腎小管上皮細(xì)胞;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路;腺苷一磷酸活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路;增殖;凋亡

Effects of Sulforaphane on the Proliferation and Apoptosis of Human Renal Tubular Epithelial Cells Induced by High Glucose and Its Mechanism

ZHOU Lei，AI Wang，CHEN Xiaojuan，WEN Chunyue（Dept. of Nephrology， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430010， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of sulforaphane on the proliferation and apoptosis of human renal tubular epithelial cells HK-2 induced by high glucose， and to investigate its mechanism primarily. METHODS： HK-2 cells were divided into normal group， high glucose group， irbesartan group （positive control， 1 μmol/L）， sulforaphane low， medium and high concentration groups （10， 20， 40 μmol/L）. The cells in normal group were cultured in DMEM medium for 96 hours. The cells in other groups were cultured in high glucose DMEM medium （containing 40 mmol/L glucose） for 48 hours. After inducing cell injury， the cells were added with corresponding drugs for 48 hours. Survival rate and apoptotic rate of cells were detected. mRNA expression of cyclin D1， caspase-3， Bcl-2 and Bax as well as protein expression of p-mTOR， p-AMPK， p-Akt and p-PI3K were also determined. In addition， HK-2 cells were divided into normal group， high glucose group， sulforaphane high concentration group （40 μmol/L）， acardicin group （AMPK agonist， 1 mmol/L）， sulforaphane high concentration+compound C group （sulforaphane 40 μmol/L+AMPK inhibitor compound C 40 μmol/L）， perifoxine group（Akt inhibitor， 19.95 μmol/L）、sulforaphane high concentration+SC79 group（sulforaphane 40 μmol/L+Akt agonist SC79 4 μmol/L）. After cultured with the same method， protein expression of p-mTOR， p-AMPK， p-Akt and p-PI3K were detected in HK-2 cells. RESULTS： Compared with normal group， survival rate of HK-2 cells， mRNA expression of cyclin D1 and Bcl-2 as well as protein expression of p-AMPK were decreased significantly in high glucose group （P<0.05）; apoptotic rate， mRNA expression of caspase-3 and Bax， protein expression of p-mTOR， p-Akt and p-PI3K in HK-2 cells were increased significantly （P<0.05）. Compared with high glucose group， above indexes of sulforaphane low， medium and high concentration groups， irbesartan group were all improved significantly （P<0.05）; the improvement of above indexes in sulforaphane medium and high concentration groups were significantly better those of sulforaphane low concentration group （P<0.05）. There was no significant difference in above indexes between sulforaphane high concentration group and irbesartan group （P>0.05）. Compared with sulforaphane high concentration group， there were no significant difference in the protein expression of p-AMPK， p-mTOR in acardicin group and p-mTOR， p-Akt and p-PI3K in perifoxine group （P>0.05）; the protein expression of p-AMPK in sulforaphane high concentration+compound C group was decreased significantly （P<0.05）， while the protein expression of p-mTOR was increased significantly （P<0.05）; the protein expression of p-mTOR、p-Akt、p-PI3K in sulforaphane high concentration+SC79 group were increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Sulforaphane can promote the proliferation of renal tubular epithelial cells and inhibit its apoptosis; its mechanism may be associated with up-regulating the expression of p-AMPK and down-regulating the expression of p-mTOR， p-Akt and p-PI3K.

KEYWORDS? ?Sulforaphane; High glucose; Human renal tubular epithelial cells; PI3K/Akt signaling pathway; AMPK/mTOR signaling pathway; Proliferation; Apoptosis

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發(fā)癥，是嚴(yán)重危害人類身體健康的重大疾病之一。有研究表明，持續(xù)的高糖環(huán)境可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是腎小管上皮細(xì)胞損傷的重要原因之一[1]。而腎小管上皮細(xì)胞損傷是糖尿病腎病的關(guān)鍵誘發(fā)因素，亦是導(dǎo)致糖尿病腎病轉(zhuǎn)向終末期的重要原因[2-3]。蘿卜硫素是一種天然的單體物質(zhì)，廣泛分布于十字花科植物中。有研究指出，蘿卜硫素在緩解2型糖尿病患者胰島素抵抗方面的效果較好，但其機(jī)制尚不明確[4]。有研究報道，蘿卜硫素可通過抑制核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶1信號通路來緩解過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，而氧化應(yīng)激損傷是促進(jìn)腎臟組織細(xì)胞凋亡和壞死的因素之一[5-6]。

已有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是蘿卜硫素及其衍生物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑之一[7]。此外，蘿卜硫素還可通過激活A(yù)kt來增強(qiáng)Nrf2介導(dǎo)的外源抗氧化防御，且Akt和腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化可以下調(diào)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[8]?；诖耍狙芯繑M通過建立高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，考察蘿卜硫素對其增殖、凋亡的影響，并基于PI3K/Akt、AMPK/mTOR雙信號通路初步探討其可能的作用機(jī)制，旨在為闡明蘿卜硫素治療糖尿病腎病的機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括：Multiskan SkyHigh型全波長酶標(biāo)儀、VeritiPro 96-Well型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀、Form Steri-Cycle型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），Mini-Protean型小垂直板電泳槽、ChemiDoc MP全能型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

DL-蘿卜硫素對照品（批號C4441，純度≥90%）、AMPK激動劑阿卡地新對照品（批號A9978，純度98%）、AMPK抑制劑6-{4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基}-3-（4-吡啶基）吡唑并[1，5-A]嘧啶對照品（compound C，批號1133922，純度98%）均購自美國Sigma公司;厄貝沙坦原料藥（陽性對照，批號20190602，純度96%）購自浙江華海藥業(yè)股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基（批號A4192101）、胎牛血清（批號30044333）均購自美國Gibco公司;0.25%胰蛋白酶（批號J6524）購自以色列BI公司;青霉素-鏈霉素混合溶液（批號C0222）、5×loading buffer（批號P0015L）、脫脂奶粉（批號P0216）、Akt激動劑2-氨基-6-氯-α-氰基-3-（乙氧羰基）-4H-1-苯并吡喃-4-乙酸乙酯對照品（SC79，批號SF2730，純度98%）均購自上海碧云天生物科技有限公司;MTT（批號G4000）購自美國Promega公司;二甲基亞砜（DMSO，批號2206-27-1）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;D-Hanks液（pH 7.2，批號20150504）、膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（含binding buffer，批號20160601）、蛋白提取試劑盒（批號20170901）均購自北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑（批號1401902）購自美國Invitrogen公司;PrimeScriptTM RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號AK3101）、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（批號AI21785A）均購自日本TaKaRa公司;細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（Bax）PCR引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計、合成，引物序列與產(chǎn)物長度見表1;Akt抑制劑哌立福辛對照品（批號M1823，純度98%）購自美國AbMole公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號23225）、ECL發(fā)光液（批號32209）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;兔源磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）單克隆抗體（批號ab32089）、兔源磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）單克隆抗體（批號ab38449）、兔源磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）單克隆抗體（批號ab133448）、兔源磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）單克隆抗體（批號ab109268）、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號ab181602）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號ab205718）均購自英國Abcam公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自武漢普諾賽生命科技有限公司，于-80 ℃凍存，備用。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HK-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 u/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“DMEM完全培養(yǎng)基”）中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），待細(xì)胞生長至90%左右時，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化，再用DMEM完全培養(yǎng)基終止后，收集細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

2.2 分組、造模與給藥

將對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞分為正常組、高糖組、厄貝沙坦組（1 μmol/L[9]）和蘿卜硫素低、中、高濃度組（10、20、40 μmol/L，濃度根據(jù)前期實驗結(jié)果設(shè)置），用于考察細(xì)胞存活率、凋亡率及相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)。另將對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞分為正常組、高糖組、蘿卜硫素高濃度組（40 μmol/L，濃度參考本研究存活率檢測結(jié)果設(shè)置）、阿卡地新組（1 mmol/L[10]）、蘿卜硫素高濃度+compound C組（蘿卜硫素40 μmol/L+compound C 40 μmol/L[11]）、哌立福辛組（19.95 μmol/L[12]）、蘿卜硫素高濃度+SC79組（蘿卜硫素40 μmol/L+SC79 4 μmol/L[13]），用于驗證信號通路的作用。正常組細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，其余各組細(xì)胞均用高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含40 mmol/L葡萄糖，下同）培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，再加入相應(yīng)濃度的藥物繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.3 細(xì)胞存活率的檢測

采用MTT法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液，以1×105個/孔接種于96孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，另設(shè)不含藥物和細(xì)胞的空白對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，室溫孵育4 h;棄去培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，避光振蕩10 min，使用全波長酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=[（實驗組A值-空白對照組A值）/（正常組A值-空白對照組A值）]×100%。實驗重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞凋亡率的檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液，以5×105個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞分別置于15 mL離心管（細(xì)胞密度≥1×106個/管）中，以1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀;用1×D-Hanks液重懸和洗滌細(xì)胞2次，再用binding buffer重懸，使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個/mL，每管加入Annexin Ⅴ-FITC試劑5 μL，室溫避光孵育10 min;加入PI試劑5 μL，室溫避光孵育5 min;再加入PBS至500 μL，輕輕混勻，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，計算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率（%）=細(xì)胞早期凋亡率+細(xì)胞晚期凋亡率+壞死細(xì)胞率。實驗重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞中cyclin D1、caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的檢測

采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以1×106個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明書方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述cDNA為模板，按qRT-PCR試劑盒說明書方法進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）如下：2×TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，cDNA模板2 μL，加焦碳酸二乙酯（DEPC）水至20 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔCt 法計算各組細(xì)胞中cyclin D1、caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞中p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以1×106個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書方法提取總蛋白，測定蛋白濃度，用5×loading buffer稀釋后，置于沸水中加熱5 min使蛋白變性。取變性后的蛋白樣品40 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后采用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、p-PI3K、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用TBST緩沖液洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），室溫孵育1.5 h;用TBST緩沖液洗滌3次，用ECL發(fā)光液顯影，并置于凝膠成像系統(tǒng)下成像。使用Image J v1.8.0軟件分析各條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞存活率的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞的存活率顯著降低（P<0.05）。與高糖組比較，蘿卜硫素低、中、高濃度組和厄貝沙坦組細(xì)胞的存活率均顯著升高（P<0.05）。與蘿卜硫素低濃度組比較，蘿卜硫素中、高濃度組細(xì)胞的存活率均顯著升高（P<0.05）。與厄貝沙坦組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞的存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1。

3.2 蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡率的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P<0.05）。與高糖組比較，蘿卜硫素低、中、高濃度組和厄貝沙坦組細(xì)胞的凋亡率均顯著降低（P<0.05）。與蘿卜硫素低濃度組比較，蘿卜硫素中、高濃度組細(xì)胞的凋亡率均顯著降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖2、圖3。

3.3 蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中cyclin D1、caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。與高糖組比較，蘿卜硫素低、中、高濃度組和厄貝沙坦組細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與蘿卜硫素低濃度組比較，蘿卜硫素中、高濃度組細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，高糖組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。與高糖組比較，蘿卜硫素低、中、高濃度組和厄貝沙坦組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與蘿卜硫素低濃度組比較，蘿卜硫素中、高濃度組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與厄貝沙坦組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞中p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖4、表3。

3.5 AMPK/mTOR、PI3K/Akt雙信號通路作用的驗證

與正常組比較，高糖組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。與高糖組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。

3.5.1 AMPK/mTOR信號通路 與高糖組比較，阿卡地新組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），p-mTOR蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;與蘿卜硫素高濃度組比較，阿卡地新組細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與蘿卜硫素高濃度組比較，蘿卜硫素高濃度+compound C組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），p-mTOR蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖5、表4。

3.5.2 PI3K/Akt信號通路 與高糖組比較，哌立福辛組細(xì)胞中p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）;與蘿卜硫素高濃度組比較，哌立福辛組細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與蘿卜硫素高濃度組比較，蘿卜硫素高濃度+SC79組細(xì)胞中p-mTOR、p-Akt、p-PI3K蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），p-AMPK蛋白的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖6、表5。

4 討論

有研究表明，cyclin D1作為細(xì)胞周期蛋白，可以正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。caspase-3是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，可通過促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)來激活caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[15]。Bcl-2、Bax分別是Bcl家族中最主要的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[16]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，高糖組細(xì)胞的存活率和細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均顯著降低，凋亡率和細(xì)胞中caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)量均顯著升高。與高糖組比較，蘿卜硫素低、中、高濃度組細(xì)胞的存活率和細(xì)胞中cyclin D1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均顯著升高，凋亡率和細(xì)胞中caspase-3、Bax mRNA的表達(dá)量均顯著降低，其中蘿卜硫素中、高濃度組上述指標(biāo)的改善效果較蘿卜硫素低濃度組更顯著。這說明高糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率;而蘿卜硫素可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，且有濃度依賴性。

已有研究報道，厄貝沙坦可顯著抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡并且促進(jìn)其增殖，且厄貝沙坦在臨床上可有效治療2型糖尿病腎病患者早期的腎小管損傷[16-18]。為此，本研究以厄貝沙坦作為陽性對照藥物，對比厄貝沙坦與蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果顯示，與厄貝沙坦組比較，蘿卜硫素高濃度組細(xì)胞的存活率、凋亡率和cyclin D1、caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明高濃度蘿卜硫素對上述指標(biāo)的影響與厄貝沙坦相當(dāng)。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過影響體內(nèi)很多信號通路（如mTOR等）的激活，從而調(diào)控體內(nèi)代謝[19]。既往研究表明，AMPK可以通過磷酸化激活體內(nèi)糖代謝，從而恢復(fù)機(jī)體對葡萄糖的攝取[20]。除此以外，AMPK還可以通過下調(diào)mTOR的磷酸化水平來改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[21]。Lee等[22]發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)腎小球細(xì)胞GMCs中p-AMPK的表達(dá)減少，同時連接蛋白CX43的表達(dá)亦有所下降;而激活A(yù)MPK可以降低mTOR的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的CX43下調(diào)，從而延緩GMCs衰老[23]。本研究結(jié)果顯示，與高糖組比較，蘿卜硫素可上調(diào)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中p-AMPK的表達(dá)，下調(diào)p-mTOR的表達(dá)，且有濃度依賴性，其中蘿卜硫素高濃度組的改善效果與厄貝沙坦組相當(dāng)。這說明蘿卜硫素對腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能與調(diào)控AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。為了進(jìn)一步驗證該機(jī)制，本研究考察了AMPK激動劑阿卡地新以及AMPK抑制劑compound C與高濃度蘿卜硫素聯(lián)用對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中AMPK/mTOR信號通路的影響。結(jié)果顯示，與高糖組比較，阿卡地新組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著升高，p-mTOR蛋白的表達(dá)量顯著降低，該作用與蘿卜硫素高濃度組相當(dāng)。與蘿卜硫素高濃度組比較，蘿卜硫素高濃度+compound C組細(xì)胞中p-AMPK蛋白的表達(dá)量顯著降低，p-mTOR蛋白的表達(dá)量顯著升高。這說明蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中AMPK/mTOR信號通路的影響與AMPK激動劑一致，如果抑制AMPK的表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)蘿卜硫素的上述作用。

有研究表明，激活PI3K可以促進(jìn)Akt磷酸化，從而調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子（如forkhead box O）表達(dá)，PI3K/Akt信號通路被抑制也會導(dǎo)致p-mTOR蛋白表達(dá)水平的降低[24-25]。PI3K/Akt信號通路參與了多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，抑制PI3K/Akt信號通路激活可抑制高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善足細(xì)胞損傷，進(jìn)而減緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程[26-29]。本研究結(jié)果顯示，與高糖組比較，蘿卜硫素可下調(diào)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)，且有濃度依賴性，其中蘿卜硫素高濃度組的改善效果與厄貝沙坦組相當(dāng)。這說明蘿卜硫素可能通過抑制PI3K/Akt信號通路來抑制高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步驗證該機(jī)制，本研究考察了Akt抑制劑哌立福辛以及Akt激動劑SC79與高濃度蘿卜硫素聯(lián)用對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的影響。結(jié)果顯示，與高糖組比較，哌立福辛組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)量均顯著降低，與蘿卜硫素高濃度組水平相當(dāng)。與蘿卜硫素高濃度組比較，蘿卜硫素高濃度+SC79組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)量均顯著升高。這說明蘿卜硫素對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的影響與Akt抑制劑一致，如果激活A(yù)kt的表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)蘿卜硫素的上述作用。

綜上所述，蘿卜硫素可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，同時上調(diào)cyclin D1和Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)caspase-3和Bax的表達(dá)，其機(jī)制可能與上調(diào)p-AMPK表達(dá)，下調(diào)p-mTOR、p-Akt、p-PI3K表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-07-05 修回日期：2021-10-08）