朱冠宇 李阿峰 朱含九 李 楠

(1 海南省瓊海市人民醫(yī)院口腔科，瓊海市 571400，電子郵箱：z26coolhao6t@163.com；2 陜西省商洛市中心醫(yī)院口腔科，商洛市 726000；3 陜西省商南縣中醫(yī)醫(yī)院口腔科，商南縣 726300；4 海南醫(yī)學院基礎醫(yī)學與生命科學學院，?？谑?571199)

舌鱗癌是口腔常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，舌鱗癌患者的預后較差，5年生存率低于60%[2]。因此，探究舌鱗癌的發(fā)病機制，提高舌鱗癌患者的生存率，一直是臨床研究的熱點。舒尼替尼是一種新型多靶向性的腫瘤治療藥物，可通過抑制受體酪氨酸激酶的活性阻斷腫瘤血管的生成及營養(yǎng)物質的供給，從而抑制腫瘤細胞的惡性增殖[3]。李金恒[4]發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼通過阻斷信號轉導和轉錄激活因子3通路可抑制頭頸癌細胞增殖；胡方寬等[5]發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可誘導食管癌細胞凋亡。但舒尼替尼在舌鱗癌發(fā)生和發(fā)展中的作用尚未有研究報道。而有研究顯示，舒尼替尼可提高自然殺傷(natural killer,NK)細胞對腎透明細胞癌細胞的殺傷敏感性[6]。這提示舒尼替尼可能通過促進NK細胞的活化性受體與腫瘤細胞的NK細胞活化性受體的配體結合來提高NK細胞對腫瘤細胞的殺傷力。研究顯示，舒尼替尼不僅可促進耐藥鼻咽癌CNE2/DDP細胞表達活化性受體自然殺傷細胞2族成員D(natural killer group 2 member D，NKG2D)的配體(NKG2D ligand，NKG2DL)來抑制耐藥鼻咽癌的免疫逃逸[7]，還可通過激活核轉錄因子кB旁路途徑誘導人肝癌HepG2細胞NKG2DL的表達來增強NK 細胞的殺傷活性[8]。以上研究表明，舒尼替尼可通過提高腫瘤細胞NKG2DL的表達，增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷敏感性。本研究探討舒尼替尼對舌鱗癌CAL27細胞增殖和凋亡的影響，旨在闡明舒尼替尼對CAL27細胞NKG2DL表達及NK細胞殺傷敏感性的影響，為舌鱗癌的抗腫瘤免疫逃逸的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 舌鱗癌CAL27細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號：12633012)、胎牛血清(貨號：10100147)和胰酶(貨號：25200072)購自美國Gibco公司。淋巴細胞分離液(貨號：P8610)購自北京索萊寶生物科技有限公司。NK細胞培養(yǎng)基(貨號：NK-92)購自上海語純生物科技有限公司。細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：88-8005-74)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。藻紅蛋白標記的CD3(貨號：741999)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的CD56(貨號：559043)、MICA(貨號：558352)、MICB(貨號：558032)、ULBP1(貨號：748133)、ULBP2(貨號：748134)、ULBP3(貨號：748128)、NKG2D(貨號：563266)單抗、山羊抗鼠二抗(貨號：682973)和兔抗鼠的二抗(貨號：684963)均購自美國BD公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放檢測試劑盒(貨號：LM-4860-1)購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。蘋果酸舒尼替尼(貨號：341031-54-7)購自美國輝瑞公司。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)購自Sigma公司(貨號：P5368-10PAK)。FITC-膜聯(lián)蛋白(Annexin)V(貨號：P-CA-101)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。結合緩沖液(貨號：R2131)購自北京索萊寶科技有限公司。TBST(貨號：T9039)購自Sigma公司。氯化氫(貨號：R21766)購自上海尚寶生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) CAL27細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；收集對數(shù)生長期的CAL27細胞，分為未處理組和舒尼替尼組，其中舒尼替尼組加入含1 μmol/L 舒尼替尼、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)中，在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，未處理組細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)24 h。

1.3 細胞克隆形成實驗檢測CAL27細胞的增殖能力 收集各組細胞，以每孔1×104個細胞接種于6孔板內(nèi)，置于飽和濕度、37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，觀察細胞，棄上清，用PBS洗滌細胞，加入1 mL體積分數(shù)為4%的多聚甲醛，4℃固定細胞1 h，PBS洗滌細胞后，加入1 000 μL的結晶紫染色液作用細胞2 min，加入1 mL雙蒸水(double distilled H2O，ddH2O)洗滌細胞。晾干后，采用倒置顯微鏡(×200)觀察細胞克隆數(shù)目，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)目×100%，實驗重復3次。

1.4 流式細胞術檢測CAL27細胞凋亡及NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)的表達 用胰酶將各組細胞消化后，在4℃、12 000 r/min條件下離心5 min，然后用-20℃預冷的PBS洗滌細胞。避光條件下，加入10 μL FITC-Annexin V和5 μL碘化丙啶，靜置15 min，加入500 μL結合緩沖液混勻后置于冰上，利用流式細胞儀(Thermo Scientific公司，型號：A24863)檢測細胞凋亡情況。其中，設未加抗體的細胞為空白對照組。細胞凋亡率=Annexin V(+)碘化丙啶(-)細胞/所有細胞，細胞經(jīng)Annexin V和碘化丙啶染色后，流式細胞術分析可產(chǎn)生明顯的細胞分群，根據(jù)細胞分群圈門確定凋亡細胞數(shù)量，Annexin V(+)且碘化丙啶(-)的細胞為凋亡細胞。收集各組CAL27細胞，利用PBS洗滌并重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5.5×104個/mL后，接種于96孔板內(nèi)。根據(jù)1 μg/106個細胞分別加入2.0 μL MICA、1.6 μL MICB、3.5 μL ULBP1、1.7 μL ULBP2和2.3 μL ULBP3抗體，每孔設置5個復孔，4℃孵育細胞25 min，PBS洗滌細胞，加入5 μL FITC標記的山羊抗鼠二抗，4℃孵育30 min，PBS洗滌3次，利用流式細胞儀分析陽性細胞，熒光一抗所標記的發(fā)光細胞為陽性細胞。實驗重復3次。

1.5 NK細胞分離及純度鑒定 根據(jù)淋巴細胞分離液的操作說明分離4例健康人(志愿者)外周血獲得單個核細胞，加入NK細胞培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。PBS洗滌重懸NK細胞，調(diào)整細胞濃度至1×107個/mL，依次加入10 μL藻紅蛋白標記的CD3抗體、10 μL FITC標記的CD56抗體，室溫避光條件下孵育20 min后，采用PBS重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/100 μL，利用流式細胞儀檢測NK細胞表型。實驗重復3次。NK細胞純度=CD3-CD56+細胞/所有活細胞，細胞經(jīng)CD3和CD56染色后，流式細胞術分析可產(chǎn)生明顯的細胞分群，根據(jù)細胞分群圈門確定NK細胞(即CD3-CD56+細胞)數(shù)量。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3蛋白表達 采用RIPA細胞裂解液裂解各組CAL27細胞，提取細胞總蛋白，利用二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測細胞蛋白濃度。取95℃高溫變性后的150 μg蛋白，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離等量蛋白，將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，用TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5.0 μL MICA(1 ∶1 000)、4.2 μL MICB(1 ∶1 200)、3.3 μL ULBP1(1 ∶1 500)、5.0 μL ULBP2(1 ∶1 000)和3.3 μL ULBP3(1 ∶100)抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠的二抗(1 ∶1 000)，37℃孵育1 h，TBST洗膜5次，5 min/次。以GAPDH(1 ∶3 000)為內(nèi)參蛋白，顯影曝光后，利用Image-Pro Plus圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。實驗重復3次。

1.7 LDH釋放法檢測NK細胞對CAL27細胞的殺傷敏感性 收集未處理組的CAL27細胞與舒尼替尼組的CAL27細胞，并將其設為靶細胞，用無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸兩組細胞，倒置顯微鏡(×100)下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至4×105個/mL。收集1.5中的NK細胞，PBS洗滌重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，將NK細胞分為NKG2D單抗組和對照組，NKG2D單抗組加入NKG2D單抗(5.0 μL MICA、5.0 μL MICB、2.5 μL ULBP1、2.5 μL ULBP2和2.5 μL ULBP3)與50 μL NK細胞孵育20 min，對照組不加入NKG2D單抗孵育。再將舒尼替尼組的CAL27細胞分為舒尼替尼-NKG2D組和舒尼替尼-對照組，舒尼替尼-NKG2D組加入NKG2D單抗組的NK細胞，舒尼替尼-對照組加入對照組的NK細胞，同時未處理組加入對照組的NK細胞(作為未處理-NK組)，并將加入NK細胞處理的CAL127細胞設為效應細胞。利用無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸各組效應細胞，倒置顯微鏡(×200)下計數(shù)，調(diào)整效應細胞密度至2×106個/mL、4×106個/mL及8×106個/mL。按照效靶比為5 ∶1、10 ∶1及20 ∶1將效應細胞及靶細胞加入96孔板內(nèi)，按LDH試劑盒操作說明書設為實驗組。同時設置效應細胞自然釋放組、靶細胞自然釋放組及靶細胞最大釋放組，效應細胞自然釋放組加入效應細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞自然釋放組加入靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞最大釋放組加入靶細胞和效應細胞各100 μL。每組各設置6個復孔。將96孔板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育6 h，4℃條件下12 000 r/min離心5 min后，每孔吸取100 μL細胞上清置于96孔板內(nèi)，加入100 μL LDH溶液反應5 min后，加入1 mol/L的氯化氫溶液30 μL，利用酶標儀(中國賽默飛世爾科技公司，型號：51119570)在490 nm處檢測光密度值(OD值)。計算NK細胞的殺傷活性，NK細胞的殺傷活性=(實驗組OD值-效應細胞自然釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 舒尼替尼對舌鱗癌CAL27細胞增殖和凋亡的影響 細胞克隆形成實驗結果顯示，與未處理組相比，舒尼替尼組的CAL27細胞克隆形成率降低(P<0.05)。流式細胞術實驗結果顯示，與未處理組相比，舒尼替尼組的CAL27細胞的凋亡率增加(P<0.05)，見表1和圖1、圖2。

表1 舒尼替尼對舌鱗癌CAL27細胞增殖和凋亡的影響(x±s，%)

圖1 舒尼替尼對CAL27細胞增殖的影響

圖2 舒尼替尼對CAL27細胞凋亡的影響

2.2 NK細胞純度的鑒定 流式細胞術實驗結果顯示，CD3-CD56+的NK細胞純度在90%以上，見圖3。

圖3 CD3-CD56+的NK細胞注：左圖和中圖代表NK細胞的分選方法，左圖為淋巴細胞分選，中圖為CD3-CD56+的NK細胞分選。右圖為NK細胞的純度檢測。

2.3 舒尼替尼對CAL27細胞NKG2DL蛋白表達水平的影響 蛋白免疫印跡實驗和流式細胞術實驗結果均顯示，與未處理組相比，舒尼替尼組的CAL27細胞中的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2蛋白表達水平、陽性細胞數(shù)均升高(均P<0.05)，而ULBP3蛋白表達水平、陽性細胞數(shù)未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，見表2、圖4、圖5。

表2 舒尼替尼對CAL27細胞NKG2DL蛋白表達水平的影響(x±s)

圖4 舒尼替尼對CAL27細胞NKG2DL蛋白表達的影響(A為未處理組，B為舒尼替尼組)

圖5 舒尼替尼對CAL27細胞NKG2DL蛋白表達的影響注：A為MICA，B為MICB，C為ULBP1，D為ULBP2，E為ULBP3。

2.4 舒尼替尼對NK細胞殺傷CAL27細胞的敏感性的影響 LDH實驗結果顯示，與未處理組-NK相比，不同效靶比下，NK細胞對經(jīng)舒尼替尼處理的CAL27細胞的殺傷敏感性均增強(均P<0.05)，見表3。

表3 舒尼替尼對NK細胞殺傷CAL27細胞敏感性影響的比較(x±s，%)

2.5 NKG2D抗體對NK細胞殺傷舒尼替尼處理的CAL27細胞的敏感性影響 LDH實驗結果顯示，不同效靶比下，與舒尼替尼-對照組比較，舒尼替尼-NKG2D組CAL27細胞的殺傷敏感度降低(均P<0.05)，見表4。

表4 NKG2D抗體對NK細胞殺傷CAL27細胞敏感性的影響(x±s，%)

3 討 論

舌鱗癌是口腔癌中最易發(fā)生淋巴轉移的腫瘤，由于生活方式和環(huán)境的改變，舌鱗癌的發(fā)病率持續(xù)升高[9]，發(fā)病率位列全身惡性腫瘤的第六位[10]。目前，臨床針對舌鱗癌的治療是以手術為主、放化療為輔的綜合治療，但治療效果不理想，因此探究藥物治療舌鱗癌的作用機制，對臨床治療舌鱗癌具有重要意義。

舒尼替尼是一種小分子吲哚酮化合物，可抑制血小板源性生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子受體、原癌基因c-kit、fms相關酪氨酸激酶3和ret原癌蛋白的活性，同時抑制腫瘤血管生成，導致腫瘤細胞凋亡和腫瘤萎縮，是臨床應用廣泛的抗腫瘤藥物[11]。近年有研究顯示，舒尼替尼可以抑制腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Korashy等[12]發(fā)現(xiàn)，舒尼替可抑制乳腺癌細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡；Thakur等[13]發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可通過抑制內(nèi)質網(wǎng)應激介導的自噬促進胰腺癌細胞的自噬。本研究結果顯示，與未處理組相比，舒尼替尼組CAL27細胞的克隆形成率降低、凋亡率增加(P<0.05)，這提示舒尼替尼可抑制舌鱗癌CAL27細胞的增殖，促進CAL27細胞的凋亡，說明舒尼替尼具有抑制舌鱗癌發(fā)生和發(fā)展的作用。

NK細胞是機體抗腫瘤免疫的重要淋巴細胞，當其活化性受體NKG2D與腫瘤細胞的NKG2DL結合，給予NK細胞強烈的活化性信號，促使NK細胞殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞的免疫逃逸[14]。NKG2DL是NKG2D的相應配體，包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3等，其表達的變化直接影響NK細胞對腫瘤細胞的殺傷性。隨著對機體抗腫瘤免疫機制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可通過降低其NKG2DL的表達逃避NK細胞的免疫殺傷，促進自身的發(fā)生和發(fā)展[15]。因此，提高腫瘤細胞NKG2DL的表達，是抑制腫瘤細胞免疫逃逸的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)[8]，舒尼替尼可促進肝癌細胞表達NKG2DL(MICA、MICB和ULBP2)，提高NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性。這說明舒尼替尼具有抗腫瘤免疫逃逸的功能。本研究結果顯示，與未處理組相比，舒尼替尼組的CAL27細胞中的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2蛋白表達水平均升高，且NK細胞對經(jīng)舒尼替尼處理的CAL27細胞的殺傷敏感性增強(均P<0.05)，這提示舒尼替尼可促進CAL27細胞NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1和ULBP2)的表達，增強NK細胞對CAL27細胞的殺傷敏感性。此外，利用NKG2D抗體作用于NK細胞，發(fā)現(xiàn)NK細胞對經(jīng)舒尼替尼處理的CAL27細胞的殺傷敏感性降低(P<0.05)。這提示舒尼替尼能夠促進CAL27細胞NKG2DL的表達，NKG2D與NKG2DL結合后增強了NK細胞對CAL27細胞的殺傷敏感性。

綜上所述，舒尼替尼可抑制舌鱗癌細胞CAL27細胞的增殖，促進其凋亡，并通過促進CAL27細胞NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1和ULBP2)的表達來增強NK細胞對CAL27細胞的殺傷敏感性，為臨床進一步探究舌鱗癌的免疫治療提供了新的思路。