朱雄林 馮顯紅 楊 梅 章革民 姚廣冰

(湖北省武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院1 感染科，2 檢驗科，3 婦產(chǎn)科，武漢市 430400，電子郵箱：4047695@qq.com)

結(jié)核病一種是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的慢性傳染病。近年來，隨著我國步入老齡化社會，老年人群的結(jié)核病呈高發(fā)趨勢，并具有高復(fù)發(fā)率、高耐藥性、高死亡率等特征[1]，是臨床防治的重點。有研究顯示，宿主個體免疫狀況的差異會顯著地影響結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展[2]。因此，準確闡明不同結(jié)核病人群的各免疫細胞的表達水平及狀態(tài)，對臨床診治有著積極意義。

T淋巴細胞的免疫應(yīng)答是人體抗結(jié)核感染的主要機制[3]。恒定自然殺傷T淋巴細胞(invariant natural killer T lymphocytes,iNKT)是一類 CD1d 限制性T淋巴細胞，在結(jié)核感染過程中能夠以CD1依賴的方式顯著地抑制結(jié)核桿菌的復(fù)制，降低肺臟中的結(jié)核桿菌載量，在整個免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用[4]。本研究分析老年結(jié)核病患者外周血中iNKT的比例、表型及功能狀態(tài)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5月至2019年5月武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院收治的150例結(jié)核病患者，納入標(biāo)準：(1)均符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的診斷標(biāo)準[5]，并經(jīng)胸部影像學(xué)、痰標(biāo)本涂片抗酸桿菌等檢查確診；(2)均對本研究知情同意。排除標(biāo)準：(1)合并心肝腎肺等器官功能衰竭者，或嚴重的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病者；(2)合并支氣管結(jié)核、陳舊性結(jié)核以及其他感染性疾病者；(3)近期使用免疫抑制劑者。根據(jù)年齡將結(jié)核病患者分為老年結(jié)核病組(≥60歲)與非老年結(jié)核病組(<60歲)，其中老年結(jié)核病組68例，年齡65～75(69.54±7.44)歲，非老年結(jié)核病組82例，年齡32～58(48.85±10.28)歲。同時選取80例老年志愿者作為對照組。納入標(biāo)準：年齡≥60歲；對本研究知情同意。排除標(biāo)準：存在影響觀察指標(biāo)的疾病或近期使用免疫抑制劑者；存在結(jié)核病以及其他危重疾病者。對照組研究對象年齡60～75(68.05±8.45)歲。3組研究對象的性別、基礎(chǔ)疾病差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，老年結(jié)核病組和非老年結(jié)核病組的抗結(jié)核治療情況差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)過武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準。

表1 3組研究對象臨床資料的比較[n(%)]

1.2 主要試劑和儀器 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國HyClone公司(批號：SH30256.01，SH30027，SV30087.01)；抗人CD3 BV421、抗人CD4 BV510、抗人CD62L藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)-cy7、抗人CD69異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記的人PBS57/CD1d四聚體均購自美國BioLegend公司(批號：563797，562971，562404，560969，564175);抗人γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)FITC、抗人CD白細胞介素4(interleukin 4,IL-4)PE-cy7、抗人CD161 PE、抗人CD122 FITC均購自美國eBioscience公司(批號：11-7311-41,25-7041-82,25-1619,11-1228);α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide,α-GalCer)購自美國Avanti Polar Lipids公司(批號：860833);淋巴細胞刺激劑氟波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、離子霉素(ionomycin,Iono)、布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)均購自美國Abcam公司(批號：ab147465，ab120370，ab120299)。FACSCalibur基本型流式細胞儀購自美國BD公司，MCO-175型CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，96孔細胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司。

1.3 檢測方法 (1)外周血單個核細胞的制備：分別抽取對照組研究對象，老年結(jié)核病組與非老年結(jié)核病組患者治療前的外周血5 mL，肝素抗凝，加入等體積的PBS稀釋。取與血樣樣本等量的淋巴分離液加入15 mL離心管中，再將稀釋好的血液加入分離液的上層，室溫下2 000 r/min離心30 min。吸取中間的灰白色淋巴細胞層，移入另一試管內(nèi)，加入10 mL PBS，室溫下1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，棄上清，加入10 mL染色緩沖液重懸細胞，獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，調(diào)整細胞數(shù)至5×106個/mL，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。(2)iNKT比例、表型的檢測：取100 μL的PBMC懸液，加入50 μL的染色緩沖液及相應(yīng)的單克隆抗體染液(抗人CD3 BV421、抗人CD4 BV510、APC標(biāo)記的人PBS57/CD1d四聚體、抗人CD161 PE、抗人CD62L PE-cy7、抗人 CD122 FITC、抗人CD69 FITC，以上抗體各5 μL)，4℃避光孵育30 min。然后用PBS重懸，室溫下1 500 r/min離心10 min，棄上清，再用PBS重懸沉淀。采用流式細胞儀檢測iNKT占淋巴細胞的比例，以及iNKT表型CD69、CD161、CD62L、CD122的表達情況。(3)iNKT分泌細胞因子的能力分析：取100 μL的PBMC懸液，加入10 μL PMA(1 ∶100)、8μL Iono(1 ∶20)，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h 激活細胞，然后加入8 μL BFA(1 ∶10)繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h。將細胞轉(zhuǎn)至流式管中，PBS洗滌1次，1 500 r/min離心10 min，50 μL染色緩沖液重懸PBMC后，加入抗人CD3 BV421、抗人CD4 BV510、APC標(biāo)記的人PBS57/CD1d四聚體以及抗人CD161 PE(以上抗體各5 μL)，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌細胞1次，室溫下1 500 r/min離心10 min，再用200 μL 4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入破膜劑1 mL，室溫下1 000 r/min離心10 min，加入50 μL染色緩沖液重懸細胞，加入抗人IFN-γ FITC、抗人CDIL-4PE-cy7各5 μL，4℃避光孵育30 min。PBS洗滌細胞1次，室溫下1 500 r/min離心10 min。加入流式緩沖液重懸細胞，使用流式細胞儀檢測IFN-γ陽性細胞比例和IL-4陽性細胞比例。另取等量PBMC懸液，不加入PMA/Iono刺激，檢測細胞因子表達情況作為各組的陰性對照。(3)iNKT的擴增能力檢測：將100 μL PBMC接種于96孔培養(yǎng)板，加入10 μL α-GalCer(200 ng/mL)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。取10 mL細胞懸液，加入50 μL染色緩沖液及相應(yīng)單克隆抗體染液(抗人CD3 BV421、抗人 CD4 BV510、APC標(biāo)記的人PBS-57/CD1d四聚體等，以上抗體各5 μL)，4℃避光孵育30 min。加入PBS，室溫下1 500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀再用PBS重懸。采用流式細胞儀檢測iNKT被 α-GalCer刺激后的iNKT比例。另取等量PMBC懸液，接種于96孔板，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后進行檢測，作為各組空白對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對象外周血中iNKT占淋巴細胞的比例和表型的比較 3組iNKT占淋巴細胞的比例、CD69表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中老年結(jié)核病組的iNKT占淋巴細胞比例低于非老年結(jié)核病組及對照組(P<0.05)，老年結(jié)核病組和非老年結(jié)核病組的CD69表達水平均高于對照組(P<0.05)，但老年結(jié)核病組與非老年結(jié)核病組的CD69表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組的CD161、CD62L、CD122表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 3組研究對象外周血中iNKT占淋巴細胞的比例及其各表型的比較(x±s)

2.2 3組研究對象外周血中iNKT細胞因子分泌能力的比較 3組研究對象在PMA/Iono刺激后iNKT中INF-γ、IL-4分泌陽性細胞率均較刺激前增加(均P<0.05)。但3組在刺激前、刺激后的INF-γ、IL-4分泌陽性細胞率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。

表3 3組研究對象iNKT細胞因子分泌能力的比較(x±s，%)

2.3 3組研究對象外周血中iNKT擴增能力的比較 對照組在α-GalCer刺激后iNKT占淋巴細胞的比例較刺激前增加(P<0.05)；老年結(jié)核病組與非老年結(jié)核病組在α-GalCer刺激前后的iNKT占淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。3組研究對象在α-GalCer刺激后iNKT占淋巴細胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中老年結(jié)核病組與非老年結(jié)核病組的iNKT占淋巴細胞比例均低于對照組(均P<0.05)。見表4。

表4 3組研究對象外周血中iNKT擴增能力的比較(x±s，%)

3 討 論

iNKT是一種廣泛分布于外周血中，同時具有自然殺傷細胞和T淋巴細胞部分表型及功能的細胞亞群，能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗感染等重要作用。近年來，iNKT在結(jié)核病相關(guān)的免疫發(fā)病機制中的作用受到臨床高度關(guān)注[6]。PBMC是機體免疫的重要組成部分，本研究將經(jīng)過嚴格分離培養(yǎng)獲得的足量PBMC作為檢測標(biāo)本，并采用CD3+PBS57/CD1d+來分選 iNKT，結(jié)果顯示老年結(jié)核病患者外周血中iNKT占淋巴細胞的比例低于老年志愿者(P<0.05)，這提示結(jié)核感染對老年患者iNKT水平有著較大影響。相關(guān)研究結(jié)果也表明，感染早期大量結(jié)核桿菌的存在會嚴重抑制機體免疫應(yīng)答，造成部分iNKT的損失[7]。本研究進一步對iNKT進行表面染色，結(jié)果顯示老年結(jié)核病組CD69表達水平高于對照組(P<0.05)，其余iNKT表型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CD69是T細胞體內(nèi)活化的標(biāo)志物，其高水平表達則表明iNKT處于過度活化狀態(tài)[8]。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，iNKT活化后Fas與Fas配體表達的上調(diào)可促使 iNKT進入次級淋巴組織并發(fā)揮 Fas配體介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)，會導(dǎo)致iNKT數(shù)量減少[9-10]。由此推測，iNKT活化后凋亡可能也是造成老年結(jié)核病患者外周血中iNKT比例下降的主要原因之一。

iNKT可以分泌IFN-γ(Th1型)、IL-4(Th2型)等多種細胞因子，誘導(dǎo)樹突狀細胞的活化和成熟，具有雙向介導(dǎo)保護性和調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答的功能[11]。本研究通過PMA/Iono刺激PBMC，采用胞內(nèi)細胞因子染色法分析iNKT的分泌能力。結(jié)果顯示，在PMA/Iono刺激前，老年結(jié)核病患者與老年志愿者iNKT細胞中IFN-γ和IL-4分泌陽性細胞率均保持在較低水平，經(jīng)PMA/Iono刺激后IFN-γ和IL-4分泌陽性細胞率均有明顯提升(均P<0.05)，但刺激前后兩組之間的INF-γ和IL-4分泌陽性細胞率差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，表明在老年結(jié)核病患者體內(nèi)iNKT雖然數(shù)量減少并且過度活化，但仍對PMA/Iono反應(yīng)正常，其分泌細胞因子的潛能并未發(fā)生明顯減弱。近期一項針對HBV慢性感染患者的研究結(jié)果顯示，感染者外周血中的iNKT經(jīng)PMA刺激后分泌INF-γ和IL-4的能力與正常對照組無明顯差異，而且發(fā)現(xiàn)在HBV感染過程中機體可能通過血清IL-15等細胞因子的負反饋調(diào)節(jié)機制來維持iNKT部分的細胞因子分泌能力[12]。我們推測，在結(jié)核病患者中可能也存在著與之類似的調(diào)控機制，這有待后續(xù)研究進一步論證。

α-GalCer是iNKT最強的激動劑，其可經(jīng)由T淋巴細胞受體途徑的非特異性刺激，有效增強CD1d脂類抗原的提呈能力，能夠全面地反映iNKT的真實功能狀態(tài)[13]。因此本研究在PBMC中加入α-GalCer后進行檢測，結(jié)果顯示在α-GalCer刺激后，老年志愿者iNKT占淋巴細胞的比例較刺激前提升(P<0.05)，而老年結(jié)核病組刺激前后的iNKT占淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明老年結(jié)核病患者機體中的iNKT對α-GalCer具有低反應(yīng)性，細胞功能受損嚴重，導(dǎo)致體外擴增效率降低。同時也進一步提示，在結(jié)核病iNKT分泌能力保持正常的狀態(tài)下，其功能缺陷更可能是由其自身T淋巴細胞受體基因表達受限，導(dǎo)致iNKT無法經(jīng)α-GalCer刺激在體內(nèi)正?；罨瘮U增造成[14]。

另外，本研究還比較了不同年齡段結(jié)核病患者外周血iNKT的特點，結(jié)果顯示老年結(jié)核病組iNKT占淋巴細胞的比例低于非老年結(jié)核病組(P<0.05)，但兩組患者iNKT的細胞因子分泌能力與擴增能力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。研究表明，隨著年齡的增長，人體的細胞免疫功能會出現(xiàn)明顯下降，對于結(jié)核病患者，這可能會導(dǎo)致機體相關(guān)效應(yīng)細胞對結(jié)核桿菌的吞噬作用下降，抗原體提呈功能減弱[15]，使得體內(nèi)結(jié)核桿菌持續(xù)存在并維持適度的增殖活性，影響了淋巴細胞的正常表達水平和狀態(tài)[16]。因此，老年結(jié)核病患者外周血iNKT比例較非老年結(jié)核病患者更低。但老年結(jié)核病患者病情復(fù)雜，受限于本研究樣本量，關(guān)于年齡對iNKT細胞的具體影響需要進一步擴大研究分析。

綜上所述，老年結(jié)核病患者外周血中iNKT比例下降明顯，并呈過度活化狀態(tài)，細胞因子分泌能力正常，但擴增效率降低。