于錦錦,薛雁,劉翠,陳蕾

(青島大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系，山東 青島 266071)

20世紀60年代鑒定出大麻的主要活性成分為△9-四氫大麻酚(△9-THC)[1]，而內(nèi)源性大麻素(eCBs)是由人類或動物自身合成的類似天然大麻素的生物活性物質(zhì)[2]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(ECS)主要由配體、受體以及配體的合成和降解酶組成。配體主要包括2-花生四烯基甘油(2-AG)[3]和花生四烯基乙醇酰胺(AEA)[4]，二者的三維構(gòu)象均類似于△9-THC，人體內(nèi)2-AG的含量遠高于AEA，2-AG的基礎(chǔ)水平是AEA的千倍[5-6]。大麻素1型受體(CB1R)[7]和大麻素2型受體(CB2R)[8]是eCBs作用的主要受體，均為Gi/o蛋白耦聯(lián)受體。CB1R是大腦中表達最廣泛的G蛋白耦聯(lián)受體[9]，而CB2R主要分布在免疫系統(tǒng)[3, 10]，在腦內(nèi)神經(jīng)元中有少量表達[11-12]。大量的研究結(jié)果表明，eCBs在食欲、成癮、痛覺、情緒、習慣養(yǎng)成、學習與記憶、獎賞與動機行為等方面發(fā)揮重要生理功能[2,13]。解剖學研究發(fā)現(xiàn)，CB1R在基底神經(jīng)核中廣泛分布，提示eCBs參與運動調(diào)控[14]。有文獻報道，CB1R敲除小鼠轉(zhuǎn)輪運動減少[15]。蒼白球是基底神經(jīng)核重要的組成部分，其神經(jīng)纖維可投射到基底神經(jīng)核幾乎所有核團，起著重要的運動調(diào)節(jié)功能[16]。大量研究證實，CB1R在蒼白球中的表達尤為豐富[17-18]，但蒼白球大麻素系統(tǒng)對正常大鼠運動行為的調(diào)控及其受體機制尚不清楚。因此，本研究采用爬桿實驗和提升軀體搖擺實驗等行為學方法，探討蒼白球給予人工合成大麻素WIN 55,212-2對正常大鼠運動行為的影響及受體機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 體質(zhì)量220～300 g健康雄性Wistar大鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。大鼠飼養(yǎng)在室溫(23±1)℃、濕度50%～55%、12 h-12 h晝夜交替光照條件下，自由飲水和進食。

1.1.2實驗藥品 人工合成大麻素WIN 55,212-2購自于Tocris公司，CB1R選擇性拮抗劑AM 251、CB2R選擇性拮抗劑AM 630購于Sigma公司。使用時，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，人工腦脊液稀釋至10 μmol/L。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組 將70只正常大鼠隨機分為10組。其中6組大鼠進行爬桿實驗，雙側(cè)蒼白球分別微量注射以下藥物：①人工腦脊液(含有DMSO)；②WIN 55,212-2；③AM 251；④AM 630；⑤AM 251+WIN 55,212-2；⑥AM 630+WIN 55,212-2。另外4組大鼠進行提升軀體搖擺實驗，單側(cè)蒼白球分別微量注射以下藥物：①人工腦脊液(其中含有DMSO)；②WIN 55,212-2；③AM 251+WIN 55,212-2；④AM 630+WIN 55,212-2。

1.2.2雙側(cè)蒼白球套管埋置 用80 g/L水合氯醛(0.2 g/kg)麻醉后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，在頭部正中位置做縱向切口，將骨膜剝離干凈，充分暴露前后囟，調(diào)節(jié)鼻夾高度使前后囟處于同一水平面。參考大鼠腦圖譜確定蒼白球位置：前囟后1.0 mm，旁開3.0 mm，顱骨表面下5.0 mm。在該坐標處用牙科鉆各鉆一個小孔，將外徑0.6 mm、內(nèi)徑0.4 mm、長度11.0 mm的自制不銹鋼管置入蒼白球上方，并用自凝牙托粉固定套管。術(shù)后連續(xù)3 d注射8萬單位青霉素防止感染。套管埋置后恢復(fù)5 d進行運動行為學實驗。行為學實驗結(jié)束后通過組織學檢查確定注藥位置是否在蒼白球。

1.2.3爬桿實驗 爬桿實驗用于測試動物的運動功能[19]。不銹鋼桿高100.0 cm，直徑2.5 cm，桿的頂端裝有小球，為保證桿表面粗糙，用膠布將小球及桿包裹起來。行大鼠蒼白球微量注射藥物(每側(cè)0.5 μL)后，將其頭朝上置于桿頂部位置，測試并記錄大鼠爬下的時間。實驗前讓大鼠進行爬桿訓(xùn)練1次，實驗時連續(xù)測定5次(每次測試間隔不超過30 s)，取平均值。

1.2.4提升軀體搖擺實驗 篩選沒有偏轉(zhuǎn)傾向的大鼠進行雙側(cè)埋管后恢復(fù)5 d，單側(cè)(隨機左側(cè)或右側(cè))注射藥物進行實驗。將大鼠放入大鼠籠里適應(yīng)10～20 min，捏住距尾根2.0 cm處提起大鼠，使其頭朝下鼻尖距箱底2.0 cm，觀察并記錄提尾10次中大鼠頭部左右偏轉(zhuǎn)方向及次數(shù)，計算左右搖擺的百分率。大鼠頭部偏離垂直位角度大于10°認定為搖擺行為。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 蒼白球微量注射WIN 55,212-2對大鼠爬桿時間的影響

爬桿實驗結(jié)果顯示，對照組(n=6)、WIN 55,212-2組(n=6)、AM 251組(n=6)、AM 630組(n=6)、AM 251+WIN 55,212-2組(n=9)和AM630+WIN 55,212-2組(n=6)大鼠爬桿時間分別為(7.16±0.64)、(4.29±0.52)、(6.45±0.34)、(5.81±0.17)、(6.18±0.29)、(3.99±0.30)s。6組大鼠爬桿時間差異具有統(tǒng)計學意義(F=9.436，P<0.01)。組間兩兩比較，WIN 55,212-2組大鼠爬桿時間較對照組顯著縮短(t=4.941，P<0.01)；與WIN 55,212-2組相比較，AM 251+WIN 55,212-2組大鼠爬桿時間顯著延長(t=3.565，P<0.05)，而AM 630+WIN 55,212-2組大鼠爬桿時間無明顯變化(t=0.514，P>0.05)。提示蒼白球給予WIN 55,212-2可通過激活CB1R增加大鼠運動行為。

2.2 蒼白球微量注射WIN 55,212-2對大鼠提升軀體搖擺行為的影響

提升軀體搖擺實驗結(jié)果顯示，對照組(n=9)、WIN 55,212-2組(n=9)、AM 251+WIN 55,212-2組(n=6)和AM 630+WIN 55,212-2組(n=6)大鼠的對側(cè)搖擺率分別為(50.00±2.36)%、(80.00±2.89)%、(50.00±2.18)%和(83.33± 2.11)%。單側(cè)蒼白球微量注射的4組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(H=39.830，P<0.01)。與對照組相比，WIN 55,212-2組大鼠出現(xiàn)明顯的對側(cè)搖擺行為(Z=3.641，P<0.01)；聯(lián)合給予AM 251和WIN 55,212-2可明顯阻斷WIN 55,212-2誘導(dǎo)的對側(cè)搖擺行為(Z=3.416，P<0.01)，而聯(lián)合給予AM 630和WIN 55,212-2則未能阻斷大鼠對側(cè)搖擺行為(Z=0.764，P>0.05)。

3 討 論

大麻素受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對運動行為產(chǎn)生重要影響。有文獻報道，CB1R敲除的小鼠轉(zhuǎn)輪活動減少，包括跑步距離、跑步時間和最大跑步速度均下降[15]。小鼠腹腔注射CB1R拮抗劑SR141716得到相似結(jié)果，小鼠跑步距離和速度呈劑量依賴性下降[20]。WIN 55,212-2是人工合成大麻素[21]，通過激活CB1R和CB2R產(chǎn)生多種效應(yīng)，如抑制γ-氨基丁酸(GABA)釋放[22-23]。蒼白球表達高水平的大麻素受體。爬桿實驗和提升軀體搖擺實驗是評估動物運動行為的有效方法[19]，本研究采用此兩種方法觀察蒼白球微量注射WIN 55,212-2對正常大鼠運動行為的調(diào)控及其受體機制。爬桿實驗結(jié)果顯示，雙側(cè)蒼白球微量注射WIN 55,212-2的大鼠爬桿時間明顯縮短；提升軀體搖擺實驗結(jié)果顯示，單側(cè)蒼白球微量注射WIN 55,212-2的大鼠出現(xiàn)明顯的對側(cè)搖擺行為。上述研究結(jié)果提示，蒼白球給予WIN 55,212-2可增強正常大鼠運動行為。WIN 55,212-2可非選擇性激活CB1R和CB2R。本研究進一步聯(lián)合給予WIN 55,212-2和選擇性CB1R阻斷劑或CB2R阻斷劑，觀察蒼白球WIN 55,212-2調(diào)控運動的受體機制。實驗結(jié)果顯示，蒼白球聯(lián)合給予CB1R阻斷劑AM 251可阻斷WIN 55,212-2對正常大鼠運動行為的增強效應(yīng)，而聯(lián)合給予CB2R阻斷劑AM 630則不能阻斷WIN 55,212-2對運動的調(diào)控作用，提示蒼白球給予WIN 55,212-2主要通過CB1R發(fā)揮增強大鼠運動行為的作用。早期的行為學研究也揭示，單側(cè)蒼白球、紋狀體或黑質(zhì)網(wǎng)狀帶注射CB1R激動劑CP55,940可能通過非多巴胺機制改善帕金森病模型動物運動障礙[24]。

眾所周知，蒼白球是基底神經(jīng)核功能環(huán)路的關(guān)鍵核團，起著重要的運動調(diào)節(jié)功能[25]?；咨窠?jīng)核主要通過直接通路和間接通路調(diào)節(jié)機體的隨意運動、肌緊張等。直接通路是紋狀體表達多巴胺D1受體的中型多棘GABA能神經(jīng)元與基底神經(jīng)核輸出核團(蒼白球內(nèi)側(cè)段/黑質(zhì)網(wǎng)狀帶)的單突觸聯(lián)系。間接通路則來源于紋狀體表達D2受體的中型多棘GABA能神經(jīng)元，通過蒼白球和丘腦底核發(fā)生神經(jīng)纖維聯(lián)系，再由丘腦底核發(fā)出谷氨酸能投射纖維至基底神經(jīng)核輸出核團。這些輸出核團發(fā)出抑制性GABA能神經(jīng)纖維投射到丘腦的外側(cè)腹核和前腹核，進而投射至大腦皮質(zhì)運動前區(qū)，形成一個神經(jīng)回路。直接通路提高大腦皮質(zhì)的興奮性，而間接通路作用相反，兩者相互協(xié)調(diào)、相互制約[26]。如果位于間接通路的蒼白球神經(jīng)元興奮性增加，通過其發(fā)出的GABA能神經(jīng)纖維就抑制丘腦底核，降低基底神經(jīng)核輸出核團的興奮性，從而解除其對丘腦和大腦皮質(zhì)運動區(qū)的抑制效應(yīng)，增強機體運動。本研究觀察到，蒼白球給予WIN 55,212-2可增強正常大鼠運動行為，提示W(wǎng)IN 55,212-2通過激活CB1R增加蒼白球神經(jīng)元興奮性。有文獻報道，CB1R在腦內(nèi)主要分布在突觸前末梢，可抑制GABA釋放[22-23]。蒼白球接受大量來自紋狀體神經(jīng)元軸突末梢以及蒼白球神經(jīng)元軸突側(cè)支的GABA能神經(jīng)纖維支配。我們推測，蒼白球給予WIN 55,212-2可能通過激活突觸前末梢的CB1R，減少GABA釋放，增加蒼白球神經(jīng)元興奮性，進而發(fā)揮其對運動的調(diào)控效應(yīng)。

綜上所述，蒼白球微量注射人工合成大麻素WIN 55,212-2可通過激活CB1R增強正常大鼠運動行為。本實驗結(jié)果為腦內(nèi)大麻素系統(tǒng)在運動調(diào)控中的作用研究提供了一定的實驗依據(jù)。