朱海珍，荀圳，鄧日林，田仁云，郭萌萌，陳生穩(wěn)，劉倩，郭艷霞

（1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué) 病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究所，湖南 長沙 410082；3.湖南大學(xué) 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種小的嗜肝DNA 病毒，是導(dǎo)致慢性肝病的主要原因，可導(dǎo)致病毒性肝炎、肝硬化和肝細胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）.據(jù)統(tǒng)計，全世界約有2.5 億人長期感染HBV，并有發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的風(fēng)險[1].病毒和宿主因素都對慢性HBV 感染的結(jié)果有影響，與其他病原體一樣，HBV 形成了逃避宿主的免疫防御策略，例如高比率的基因突變率和免疫調(diào)節(jié)蛋白的表達.

軸抑制蛋白Axin 是Wnt/β-catenin 信號的負調(diào)節(jié)因子，通過蛋白酶體降解途徑調(diào)節(jié)β-catenin 蛋白水平，進而抑制Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-4].然而，Axin 在HBV 感染過程中的作用尚不清楚.

PD-L1 是一種免疫檢查點分子，調(diào)節(jié)Ⅰ型T 輔助細胞（Th1）免疫反應(yīng)，介導(dǎo)癌癥免疫逃避.它可以在腫瘤細胞（TC）和腫瘤浸潤性的免疫細胞（IC）上進行表達[5].近幾年，抗PD-L1 治療手段在人類癌癥的免疫治療中占據(jù)了中心地位[6-8].然而，PD-L1 在HBV感染中的作用及其機理仍有待闡明.

泛素蛋白酶體降解途徑是目前已知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性且最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑.真核細胞內(nèi)泛素化修飾后的靶蛋白能被降解或者被轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)或細胞外的特定部位.靶蛋白的泛素化修飾需要E3 泛素連接酶的參與，E3 泛素連接酶通過調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過程參與細胞內(nèi)的多種生理過程[9].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，HBV 感染可對細胞內(nèi)多種生命活動產(chǎn)生影響，如影響轉(zhuǎn)錄因子的表達，促使Caspase 剪切從而促使細胞凋亡等.然而，HBV是否能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)一些E3 連接酶的表達，進而調(diào)節(jié)泛素蛋白酶體途徑尚不清楚.

本文從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后的修飾水平對Axin 和PD-L1 的關(guān)系進行了探討，發(fā)現(xiàn)Axin 可能通過調(diào)節(jié)PD-L1 的E3 連接酶的表達，調(diào)控PD-L1 的翻譯后修飾；同時，還發(fā)現(xiàn)Axin 能夠逆轉(zhuǎn)HBV 引起的PD-L1 上調(diào)現(xiàn)象.本研究為HBV 免疫逃逸機理提供參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細胞系

Huh7 細胞為美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉晨教授實驗室惠贈；BGC-823 購自Boster 公司；HEK293T 購自美國ATCC；HLCZ01 細胞系由本實驗室從臨床病人肝組織中分離培養(yǎng)得到[10].

1.2 試 劑

高糖（DMEM）培養(yǎng)基和DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Invitrogen 公司），1×PBS（Hyclone 公司），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen 公司），細胞RNA 收取Trizol 試劑（Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Accurate Biology 公司），SYBR Green 定量試劑盒（Accurate Biology 公司），蛋白酶抑制劑片劑（Merck 公司），細胞蛋白收取RIPA 裂解液（Thermo 公司），Axin 抗體（CST 公司），PD-L1 抗體（Proteintech 公司），F(xiàn)lag 抗體（Sigma-Aldrich 公司），V5 抗體（Invitrogen 公司），β-actin 抗體（Sigma-Aldrich 公司）.

60 mm 的細胞培養(yǎng)皿（Biologix 公司），十二孔細胞培養(yǎng)板（Biologix 公司），10 cm 的細胞培養(yǎng)皿（Biologix 公司），1.5 mL 的離心管（Axygen 公司），200 μL PCR 八聯(lián)管（Axygen 公司），0.22 μm 和0.45 μm 的PVDF 膜（Merck Millipore 公司）.

1.3 儀器設(shè)備

4 ℃冰箱（中科美菱公司），-20 ℃冰箱（Haier 公司），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo 公司），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司），生物安全柜（Airtech 公司），凝膠核酸成像（上海天能公司），蛋白核酸曝光成像儀器（Bio-rad 公司），細胞計數(shù)儀（Beckman 公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司），細胞液氮凍存罐（Thermo 公司），分析天平（上海天平儀器廠），Nanodrop2000（Thermo 公司），實時熒光定量PCR 儀（湖南達爾儀器有限公司），普通PCR 儀（Eppendorf 公司），制冷高速離心機（Eppendorf 公司）.

1.4 實驗方法

1.4.1 HBV 感染方法

用于實驗感染細胞的HBV 來自HepG2.2.15 細胞上清（D 型）.在培養(yǎng)HepG2.2.15 細胞時，在培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的新霉素（G418）來維持HBV 基因組的復(fù)制水平.當(dāng)HepG2.2.15 細胞開始產(chǎn)生病毒時，用不加G418 的培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2.2.15 細胞，一邊擴大培養(yǎng)細胞一邊收集細胞上清，收集的細胞上清用0.45 μm 微孔過濾器過濾，使病毒得以富集，最后測定病毒滴度.HBV 按照MOI為20 接種于HLCZ01 細胞，病毒與細胞孵育過夜后，去除培養(yǎng)上清，用磷酸鹽緩沖鹽水（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌3 次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對應(yīng)的時間點.

1.4.2 過表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

為了構(gòu)建Axin、PD-L1、SPOP、Cbl 和HBX 的過表達質(zhì)粒，首先利用Primer Primer5 設(shè)計PCR 引物，然后從Huh7 細胞中提取總RNA，利用其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板來擴增Axin、PD-L1、SPOP、Cbl 基因；同時從HBV 感染的HLCZ01 細胞內(nèi)提取細胞總RNA 來擴增HBX 基因.通過膠回收純化PCR 產(chǎn)物，最后利用TA 克隆方法將擴增得到的DNA 片段連入p3×Flag-CMV 和pCDNA3.1a 載體中，從而得到重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-Axin、p3×Flag-CMV-PD-L1、p3×Flag-CMV-HBx、pCDNA3.1a-PD-L1、pCDNA3.1a-SPOP、pCDNA3.1a-Cbl，通過測序鑒定目的基因序列是否完全正確.PCR 引物序列如表1 所示.

表1 質(zhì)?？寺∫颰ab.1 Primers used for plasmid construction

1.4.3 Western blot 實驗

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer 裂解液裂解細胞，冰浴30 min，13 200 r/min 離心15 min 后收集蛋白.根據(jù)試劑說明書的使用方法，用BCA（Bicinchoninic Acid）試劑法測定蛋白濃度.取20 μg蛋白樣品與2×Load Buffer 等體積混合，在100 ℃金屬浴中煮沸5 min 之后上樣，采用80 V 恒壓跑膠，待蛋白Mark 分層后調(diào)至120 V 恒壓跑膠，根據(jù)Mark顯示的位置，待目的蛋白到達合適位置后進行轉(zhuǎn)膜.100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜成功后，以5%的脫脂牛奶封閉1 h，之后加入對應(yīng)一抗4 ℃過夜孵育，二抗選用anti-mouse 或anti-rabbit 抗體室溫孵育2～4 h.將PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光信號檢測儀上，加入預(yù)先配制好的顯影液曝光1～5 min，并保存蛋白印跡圖片.

1.4.4 Real-time PCR 實驗

使用Trizol 試劑裂解細胞，采用氯仿抽提的方法提取細胞內(nèi)總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用相對應(yīng)的定量引物進行實時熒光定量PCR 分析，探究目的基因在RNA 水平的表達情況，所用方法參照試劑盒說明書操作.Real-time PCR 反應(yīng)所用引物序列如表2 所示.

表2 Real-time PCR 反應(yīng)所用引物序列Tab.2 Primer sequences used in real-time PCR reactions

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均錄入Excel 文檔中保存，對照組數(shù)據(jù)和處理組數(shù)據(jù)之間顯著性差異分析采用學(xué)生雙尾t 值分析方法.用*P＜0.05、**P＜0.01 和***P＜0.001 來表示顯著性差異程度，其中P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義.數(shù)據(jù)以means±SD 形式在圖表中顯示.

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 HBV 感染抑制Axin 的表達和促進PD-L1 的表達

Axin 在WNT 信號通路中起重要的調(diào)控作用[11]，為了檢測Axin 在HBV 調(diào)節(jié)抗病毒免疫過程中的作用，本文檢測了HLCZ01 細胞和HBV 感染的HLCZ01 細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的表達，以探討Axin在HBV 感染過程中的潛在作用.利用實時熒光定量（Real-time PCR）方法，以MOI 為20 的HBV 感染HLCZ01 細胞45 d，提取細胞總RNA 和細胞總蛋白.利用Real-time PCR 方法，以未被HBV 感染的HLCZ01 細胞為對照，檢測細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)HBV 感染后不影響Axin 和PDL1 的轉(zhuǎn)錄水平（圖1（a））.利用Western Blot 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)HBV 感染后抑制Axin 蛋白的表達但促進PD-L1 蛋白的表達（圖1（b））.為進一步驗證這一實驗結(jié)果，在Huh7細胞中轉(zhuǎn)染表達HBV 的1.3 倍復(fù)制子的質(zhì)粒，24 h以后提取細胞總RNA 和細胞總蛋白.利用Realtime PCR 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)HBV 的1.3 倍復(fù)制子抑制Axin 的轉(zhuǎn)錄但不影響PD-L1 的轉(zhuǎn)錄（圖1（c））.借助Western Blot方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBV 的1.3 倍復(fù)制子質(zhì)粒的Huh7細胞內(nèi)的Axin 蛋白水平明顯下調(diào)，而PD-L1 的蛋白水平明顯上調(diào)（圖1（d））.在Huh7 細胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-HBx，48 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBx 質(zhì)粒的Huh7 細胞內(nèi)Axin 的蛋白水平下降，而PD-L1的蛋白水平升高（圖1（e））.基于上述實驗結(jié)果，推測HBV 導(dǎo)致Axin 和PD-L1 蛋白水平發(fā)生變化可能是通過HBx 實現(xiàn)的.此外，以MOI 為20 的HBV 感染HLCZ01 細胞45 d，然后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或2 μg），48 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 過表達情況和PD-L1 蛋白水平，研究發(fā)現(xiàn)在HBV 感染的HLCZ01 細胞內(nèi)過表達Axin 質(zhì)粒，能夠逆轉(zhuǎn)HBV 感染引起的PD-L1 蛋白水平降低現(xiàn)象（圖1（f））.由圖1 可知，在HBV 感染肝細胞內(nèi)，Axin蛋白水平與PDL1 蛋白水平呈負相關(guān)性.

圖1 HBV 感染抑制Axin 的表達和促進PD-L1 的表達Fig.1 HBV infection inhibits Axin expression and promotes PD-L1 expression

2.2 Axin 通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1蛋白

為了進一步明確Axin 與PD-L1 之間的關(guān)系，在Huh7 細胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin 可降低細胞內(nèi)PD-L1 蛋白水平（圖2（a））.在Huh7 和HEK293T 細胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后收取細胞總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)在Huh7 和293T 細胞中過表達Axin 對PD-L1 的轉(zhuǎn)錄水平并無明顯影響（圖2（b））.利用從湖南省腫瘤醫(yī)院收集48例肝癌病人癌旁組織樣本，提取組織總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測組織內(nèi)Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，并通過SPSS 軟件分析Axin 與PD-L1之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們的mRNA 并無相關(guān)性（圖2（c））.在Huh7 細胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后加入放線菌酮素（100 μg/mL CHX 終濃度），15 min 和30 min 后分別收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內(nèi)Axin 過表達情況和PD-L1 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin 對PD-L1 的翻譯水平?jīng)]有影響（圖2（d））.最后，對其翻譯后修飾水平進行探究.在Huh7 細胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后分別加溶酶體降解途徑抑制劑（NH4Cl）[12]和蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內(nèi)Axin過表達情況和PD-L1 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin 可能通過影響PD-L1 的蛋白酶體降解發(fā)揮作用（圖2（e））.另外，在HEK293T 細胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin 和pCDNA3.1a-PDL1，48 h 后加蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h 后收取細胞總蛋白，以V5 抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測細胞內(nèi)PD-L1 的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin能促進PD-L1 的泛素化（圖2（f）（g））.在Huh7 細胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或者2 μg）48 h 后，在收取蛋白前6 h，加入蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132）培養(yǎng)細胞，收取的細胞總蛋白以PD-L1 抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測細胞內(nèi)PD-L1 的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin 對PD-L1 的泛素化呈劑量依賴性.基于上述實驗結(jié)果，認為Axin 可能通過蛋白酶體途徑降解PD-L1 蛋白.

圖2 Axin 通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1 蛋白Fig.2 Axin degrades PD-L1 protein through ubiquitin proteasome pathway

2.3 Axin 通過影響E3 連接酶SPOP 的表達進而調(diào)控PD-L1 的蛋白酶體降解

蛋白與蛋白質(zhì)之間的相互作用可能是通過直接或間接方式進行的.為明確Axin 對PD-L1 蛋白的調(diào)控方式，首先，在HEK293T 細胞中共轉(zhuǎn)染帶Flag 標(biāo)簽的Axin 和帶V5 標(biāo)簽的PD-L1，通過免疫共沉淀實驗分析，發(fā)現(xiàn)Axin 與PD-L1 不存在直接相互作用（圖3（a））.間接調(diào)節(jié)PD-L1 的泛素化作用可能通過兩種方式，一種是調(diào)節(jié)其去泛素化酶的表達，另外一種是調(diào)節(jié)其泛素化酶的表達.NF-kb 信號通路活化后，可增強PD-L1 去泛素化酶的表達[13].將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin 轉(zhuǎn)染至Huh7 細胞，48 h 后分別收取細胞總蛋白，利用Western Blot 和實時熒光定量PCR 方法，發(fā)現(xiàn)Axin對NF-kb 信號通路的活化無作用（圖3（b））.有文獻報道E3 連接酶Cbl 和SPOP 可泛素化降解PDL1[14-18].將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin 轉(zhuǎn)染至Huh7 細胞，48 h 后收取細胞總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測Axin 對PD-L1的E3 連接酶Cbl 和SPOP 的mRNA 水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin 對這兩種E3 連接酶的mRNA 水平并無影響（圖3（c））.另外，將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或者2 μg）和pCDNA3.1a-Cbl或者pCDNA3.1a-SPOP 轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞，48 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測Axin 對Cbl 和SPOP 蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin 可增強SPOP 的蛋白表達（圖3（d））.有文獻報道PDL1 主要通過K48 位和K63 位進行泛素化降解[19-21]，將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMVAxin 和pCDNA3.1a-PD-L1 和野生型、K48 或者K63的HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞，以V5 抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測其對PD-L1 蛋白泛素化的影響，發(fā)現(xiàn)Axin 促進K48 依賴的PD-L1 泛素化降解（圖3（e））.

綜上所述，本文認為HBV 可能通過其HBx 下調(diào)Axin 蛋白水平，降低PD-L1 的E3 連接酶SPOP 蛋白水平，進而抑制K48 依賴的PD-L1 泛素化降解，導(dǎo)致HBV 感染肝細胞內(nèi)PD-L1 蛋白含量增加（圖3（f））.

圖3 Axin 通過影響E3 連接酶SPOP 的表達進而調(diào)控PD-L1 的蛋白酶體降解Fig.3 Axin regulates proteasome degradation of PD-L1 by affecting the expression of E3 ligase SPOP

3 討論

在HBV 誘導(dǎo)的肝細胞癌中，癌組織中的Axin蛋白水平明顯低于其鄰近組織，但HBV 下調(diào)Axin蛋白表達的機制尚不明確.本文對HBV 抑制Axin蛋白表達的機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)HBx 可能參與了HBV 對Axin 蛋白水平的下調(diào)作用.文獻[22-24]研究表明，在乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中，CD8+T 細胞功能異常且耗竭，其特征是PD-1 高表達，干擾素-γ 和腫瘤壞死因子分泌減少，但HBV 感染誘導(dǎo)細胞內(nèi)PD-L1 表達的機制仍不清楚.本文研究發(fā)現(xiàn)在HBV 感染的肝細胞內(nèi)，Axin 蛋白表達明顯下調(diào)而PD-L1 蛋白表達顯著增加.通過相關(guān)細胞實驗和臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，Axin 不能調(diào)節(jié)WNT 信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子的表達進而影響PD-L1 的轉(zhuǎn)錄水平.另外，一個蛋白影響另外一個蛋白的表達，也有可能是調(diào)節(jié)它翻譯后的降解水平來實現(xiàn)的.通過添加相關(guān)抑制劑，發(fā)現(xiàn)Axin 通過影響PD-L1 的蛋白酶體降解途徑，降低病毒感染細胞內(nèi)PD-L1 水平.進一步研究發(fā)現(xiàn)Axin 可能通過影響PD-L1 的E3 連接酶SPOP 的表達，進而發(fā)揮其促進PD-L1 泛素化降解作用，但Axin 影響SPOP 表達的具體機制仍有待進一步研究.另外，本研究只選擇了與PD-L1 相關(guān)的兩種E3 連接酶進行了研究，Axin 是否對作用于PDL1 的其他E3 連接酶有影響還有待進一步探討.