柴 燃 ， 秦 鵬 ， 吳 迪 ， 季紹東 ， 薛 強 ， 程鑫穎

（1.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲 056250；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院邯鄲市天然產(chǎn)物與功能性食品開發(fā)重點實驗室，河北邯鄲 056107；3.河北省植物資源綜合利用重點實驗室（籌），河北邯鄲 056107）

現(xiàn)代畜牧業(yè)對產(chǎn)量和效率的要求越來越高，通常使用抗生素如土霉素（孫盛明，2020）、桿菌肽鋅（Engberg，2000）、金霉素（張憬，2016）等獲得高水平產(chǎn)出， 但考慮到其對人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響（包櫻鈺，2021），全球范圍內(nèi)一直存在監(jiān)管、限制抗生素在飼料上的使用。 為了在沒有藥物的情況下保證動物的健康、快速生長，需要高質(zhì)量的飼料成分和飼料添加劑。 其中，有機酸由于對動物生長效率的積極影響而被廣泛使用（潘寶海，2019）。

萬壽菊發(fā)酵提取物是在提取萬壽菊菊花中葉黃素的過程中，通過綜合利用得到的，其主要成分為乳酸。 乳酸具有廣譜的抑制細菌和抗真菌能力， 常作為添加劑添加到飼料中（Tugnoli，2020）。 因此，為了解萬壽菊發(fā)酵提取物作為飼料添加劑的功效， 本試驗研究了其對小鼠生長性能、胃內(nèi)容物pH 及腸道微生物的影響，旨在為萬壽菊資源的綜合利用和萬壽菊發(fā)酵提取物的進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用萬壽菊發(fā)酵提取物由晨光生物技術(shù)集團股份有限公司提供，乳酸（AR級別） 購自天津大茂化學(xué)試劑廠，MH 培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)公司，鹽酸萬古霉素、阿莫西林購自上海麥克林生化科技有限公司。 在萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸中加入二氧化硅制成固態(tài)制劑，并使兩種制劑的總酸（以乳酸計）含量相當。

1.2 最小抑菌濃度（MIC）試驗 96 孔板中每孔加入MH 肉湯培養(yǎng)基100 μL。在第1 列加配好的藥液100 μL，然后對藥物進行二倍稀釋。 即第一孔中加入 100 μL 藥液（400 mg/mL）后用移液槍吹打使藥物與培養(yǎng)基充分混勻，然后吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻，照此重復(fù)直至最后倒數(shù)第二孔，吸出100 μL 扔掉。第12 列作為空白對照組（加菌液不加藥液）。再在每一孔中加入稀釋好的菌液100 μL。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h 后，觀察結(jié)果。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 剛斷奶的SPF 級雄性昆明小鼠 （周齡 3 周，19 ～ 21 g）50 只購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，試驗動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±3）℃，濕度 30% ～ 70%，自由飲食飲水，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。 小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按體重隨機對小鼠進行分組，做好標記。 1 組為對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗2、3、4 組分別在基礎(chǔ)日糧中添加 2、1.5、1.0 g/kg 的萬壽菊發(fā)酵提取物， 試驗5 組添加1.5 g/kg 乳酸，每組 10 只（分 2 籠），試驗周期為 14 d。 鼠籠根據(jù)抽簽結(jié)果隨機擺放， 避免生長環(huán)境對試驗結(jié)果造成影響。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 指標測定及方法

1.4.1 生長性能指標 分別于試驗開始喂養(yǎng)的第0、7、14 天空腹稱重，按照下列公式計算各生長階段的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.4.2 胃內(nèi)容物pH 稱取胃內(nèi)容物0.2 g， 加入6 mL 純水，振蕩靜置10 min 后測上清液pH。

1.4.3 胃蛋白酶活性 取小鼠的胃黏膜組織勻漿上清液樣本，利用BCA 法測定其蛋白含量，通過催化血紅蛋白分解法測定小鼠胃黏膜胃蛋白酶的活性，按試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 胰島素樣生長因子 （IGF-1） 小鼠眼眶取血， 室溫靜置之后，3000 r/min 離心獲得血清，按照說明書測定血清中IGF-1 含量。

1.4.5 腸道菌群測序 每組選取5 只小鼠， 分別取小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物置于試管中，干冰寄送北京諾禾致源科技股份有限公司對16S rDNA 進行測序，比較不同組間的差異。

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 21.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用one-way ANOVA 比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 萬壽菊發(fā)酵提取物對細菌的抑制能力 如表2 所示，萬壽菊發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌和沙門氏菌的MIC 和市售產(chǎn)品A 相同，對大腸桿菌的抑制作用稍弱于市售產(chǎn)品A?？傮w來說，萬壽菊發(fā)酵提取物與市售產(chǎn)品A 差別不大，具有作為飼料酸化劑的應(yīng)用潛力。

表2 不同液態(tài)有機酸對細菌的最小抑菌濃度 μg/mL

2.2 萬壽菊發(fā)酵提取物對小鼠生長性能的影響由表3 可知，在試驗第一周，與對照組相比，不同試驗組的采食量沒有明顯差別； 萬壽菊發(fā)酵提取物高劑量組（試驗2 組）和乳酸組（試驗5 組）的平均日增重較對照組分別提升16.8%、10.8%（P ＜0.05），其余試驗組平均日增重都高于對照組但不具有顯著性差異（P ＞ 0.05）；試驗 5 組 0 ~ 7 d 的料重比與對照組相比，降低10.4%。 試驗第二周，試驗組的采食量較對照組均降低，其中試驗2、4、5 組較對照組分別降低 8.9%、4.0%和9.3%（P ＜0.05）；試驗2 組和試驗5 組平均日增重較對照組降低18.0%和11.8%（P ＜0.05），試驗組料重比較對照組無顯著差異（P ＞ 0.05）。

表3 萬壽菊發(fā)酵提取物對小鼠生長性能的影響

2.3 萬壽菊發(fā)酵提取物對小鼠胃內(nèi)容物pH 的影響 由表4 可知， 對照組小鼠的胃內(nèi)容物pH最高，所有試驗組的胃內(nèi)容物pH 均低于對照組，試驗 2、4、5 組的 pH 較 1 組分別降低 1.39、1.19和 1.21（P ＜ 0.05），試驗 3 組降低 0.53（P ＞ 0.05）。與對照組相比， 各試驗組的小鼠胃蛋白酶活性和IGF-1 含量無顯著差異（P ＞ 0.05）。

表4 萬壽菊發(fā)酵提取物對小鼠胃內(nèi)容物pH、胃蛋白酶活性和IGF-1 的影響

2.4 萬壽菊發(fā)酵提取物對小鼠腸道菌群的影響利用16S rDNA 擴增子測序技術(shù)對小鼠腸道內(nèi)容物進行菌群分析，選取試驗1 組（對照組）、試驗3 組（萬壽菊發(fā)酵提取物組）和試驗5 組（乳酸組）對小鼠不同部位腸道內(nèi)容物進行測序，確定萬壽菊發(fā)酵提取物能否通過改變腸道菌群影響小鼠生長性能。 對測序結(jié)果進行Anosim 分析表明，萬壽菊發(fā)酵提取物組、乳酸組與對照組相比，只有小腸菌群的變化具有顯著性 （P < 0.05），盲腸和結(jié)腸的菌群結(jié)構(gòu)沒有明顯差異 （P > 0.05）（表 5）。

表5 Anosim 組間差異分析

小鼠腸道菌群中， 在門水平上占據(jù)主導(dǎo)地位的菌群是擬桿菌門、厚壁菌門，兩者相加能達到腸道細菌豐度的90%以上。 對照組厚壁菌門與擬桿菌門的比值為0.69，乳酸組為1.65，萬壽菊發(fā)酵提取物中劑量組為1.68， 表明乳酸和萬壽菊發(fā)酵提取物喂養(yǎng)斷奶期小鼠都會增加小腸中厚壁菌門/擬桿菌門的比值（表6）。

表6 不同組小鼠腸道細菌在門水平上的相對豐度

3 討論

飼料添加劑主要分為酸、益生元、植物產(chǎn)品、益生菌和礦物質(zhì)等（奚玉蓮，2020）。 其中，酸是代替抗生素的最佳選擇之一（Liu，2018）。在飼料上，酸最早用作酸化劑和防腐劑， 部分有機酸能參與三羧酸循環(huán)，調(diào)節(jié)微生物菌落構(gòu)成，意味著有機酸不再被視為飼料的簡單酸化劑， 而是生長促進劑和潛在的抗生素替代品（Ferronato，2020）。 乳酸最早從酸奶中分離得到， 具有良好的抗細菌和抗真菌特性。 研究表明，乳酸能參與三羧酸循環(huán)，和丙酮酸的作用類似（Rabinowitz，2020）。 乳酸還能促進動物的生長（徐青青，2020；蔣俊劼，2019），廣泛作為飼料添加劑使用。在生產(chǎn)葉黃素過程中，采摘的萬壽菊花需要用乳酸菌進行青貯 （李大婧，2008）。 為充分開發(fā)萬壽菊資源，利用萬壽菊發(fā)酵提取物進行體外抑菌試驗和小鼠喂養(yǎng)試驗。 MIC試驗表明， 萬壽菊發(fā)酵提取物與市售酸化劑具有相同的抑菌能力。 小鼠試驗研究表明， 在喂養(yǎng)第一周， 萬壽菊發(fā)酵提取物高劑量組和乳酸組的小鼠平均日增重顯著高于對照組（P < 0.05），料重比顯著低于對照組（P < 0.05），采食量沒有顯著差異（P > 0.05），說明萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠促進斷奶期小鼠的生長；在第二周，高劑量萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸反而降低小鼠的采食量， 可能是由于降低了飼料的適口性。 根據(jù)高劑量組在第一周和第二周結(jié)果的不同， 表明要根據(jù)動物的生長時期在飼料中添加不同的劑量。

為探究萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸促進小鼠生長的原因，對小鼠胃內(nèi)容物的pH、胃黏膜的蛋白酶活性和血清中的IGF-1 進行檢測。 結(jié)果表明萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠降低小鼠胃內(nèi)容物的pH， 對黏膜組織中胃蛋白酶活性和血清中的IGF-1 沒有影響。剛斷奶的幼齡動物，胃部發(fā)育不完善（Suiryanrayna，2015），會出現(xiàn)胃酸分泌不足，影響胃蛋白酶的激活， 導(dǎo)致食物消化困難（Ahmed，2014）。 也有證據(jù)表明，高 pH 會增加胃排空率，從而減少飼料在胃中的消化時間（Rayner，2012）。本研究表明，在飼料中添加萬壽菊發(fā)酵提取物能降低小鼠胃內(nèi)部的pH， 激活胃蛋白酶，促進消化吸收。

腸道菌群是個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)， 也是腸道的重要組成部分，與動物的消化吸收、健康狀況關(guān)系密切（唐強，2020）。Lee（2018）研究證明，乳酸可通過加速腸道干細胞的分化促進腸道的發(fā)育， 本研究表明， 萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠顯著改變小腸部位的菌群結(jié)構(gòu)， 增加小腸細菌中厚壁菌門的相對豐度，降低擬桿菌門的相對豐度，對盲腸和結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)影響不大。 擬桿菌門及厚壁菌門是腸道內(nèi)的優(yōu)勢有益菌，Turnbaugh 等（2007）發(fā)現(xiàn)，肥胖與擬桿菌門及厚壁菌門相對豐度的改變存在關(guān)系，通過與瘦人進行比較，發(fā)現(xiàn)胖人腸道中厚壁菌門的相對比例有所增多， 這與小鼠試驗結(jié)果一致。 能夠增加小鼠小腸中厚壁菌門與擬桿菌門細菌比例，促進腸道的消化和能量吸收，也是萬壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠降低小鼠料重比的原因。

4 結(jié)論

萬壽菊發(fā)酵提取物可作為酸化劑在飼料中添加，可通過抑制有害菌生長，降低胃內(nèi)容物的pH幫助食物消化，促進腸道發(fā)育，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和提高小鼠的生長性能。 萬壽菊發(fā)酵提取物在動物的不同生長期需要添加不同劑量， 斷奶初期需要較高劑量，后期要降低添加量。