齊春艷，黎欣欣，張 靜，雷 毅

（廣東省食品檢驗(yàn)所（廣東省酒類檢測(cè)中心），廣東廣州 510000）

保健酒是以白酒或其他酒類為酒基，選擇有治療作用和滋補(bǔ)性能的中藥或藥食同源物質(zhì)如人參、鹿茸、海馬、海參等，通過浸泡、浸漬、蒸餾等加工手段制成的飲料酒，具有滋補(bǔ)健體、緩解疲勞、行氣活血等保健作用[1-2]。面對(duì)巨大的市場(chǎng)需求和利益誘惑，一些不法商家為凸顯產(chǎn)品功能，吸引消費(fèi)者，在其產(chǎn)品中非法加入西地那非、伐地那非、育亨賓等PDE5抑制劑（5型磷酸二酯酶抑制劑），達(dá)到獲取暴利的目的[3]。由于非法添加存在隨意性大，劑量不明確等問題，消費(fèi)者若長(zhǎng)期、超量食用可能會(huì)引起心律失常、心肌梗塞、高血壓等不良反應(yīng)，甚至威脅生命安全[4]。

目前，PDE5抑制劑的檢測(cè)方法主要有膠體金免疫層析法（GICA）、薄層色譜法（TLC）、拉曼光譜法、近紅外光譜法（NIRS）、液相色譜法（LC）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等（LC-MS/MS）。其中，GICA法、TLC法、拉曼光譜法、NIRS法往往存在靈敏度低、選擇性差、假陽性等問題[5]。LC法和LC-MS/MS法因其高靈敏度和高選擇性，是目前常用的檢測(cè)方法。這些方法傳統(tǒng)檢測(cè)方法雖然前處理比較簡(jiǎn)單，但是往往存在分離分析時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)試劑消耗量大，環(huán)境污染大等缺點(diǎn)。

DART-Q-Orbitrap HRMS法是結(jié)合了敞開式常壓電離源和高分辨質(zhì)譜儀兩者優(yōu)勢(shì)的一種檢測(cè)技術(shù)。采用DART離子源進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣品無需冗長(zhǎng)的色譜分離過程，分析速度快，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定性分析。Q-Orbitrap HRMS結(jié)合了四級(jí)桿的高選擇性和離子阱的高靈敏度、高分辨率的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性。

本研究采用DART-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準(zhǔn)定性的檢測(cè)方法。該方法具有分析速度快，有機(jī)試劑用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。此外，通過一級(jí)全掃描獲得12種PDE5抑制劑的精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)各目標(biāo)物的提取離子圖進(jìn)行初步定性，同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描模式獲得12種PDE5抑制劑的二級(jí)特征質(zhì)譜圖，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的精準(zhǔn)定性。本方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性，為維護(hù)保健酒行業(yè)的健康發(fā)展和保障我國(guó)食品安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西地那非、紅地那非、偽伐地那非、氨基他達(dá)拉非、育亨賓（純度均≥99.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；羥基豪莫西地那非、那紅地那非、硫代西地那非（純度均≥99.3%，加拿大TLC標(biāo)準(zhǔn)品公司）；硫代艾地那非、伐地那非（純度均≥98.6%，美國(guó)Stanford Chemicals有限公司）；他達(dá)拉非（純度為99.2%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；去甲基他達(dá)拉非（純度為99.3%，北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；試驗(yàn)用水為一級(jí)水（自制）；GHP針式過濾器（0.22 μm，美國(guó)波爾有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DART實(shí)時(shí)直接分析離子源（美國(guó)Ion Sense公司）；Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；電子分析天平（MS105DU、PL602E，瑞士Mettler Toledo公司）；移液器（1～10 μL、10 ～ 100 μL、100 ～ 1 000 μL，1.0 ～ 10 mL，德國(guó)Eppendorf公司）；EOAA-HM-01多管渦旋混合器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（東莞科橋超聲波設(shè)備有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并定容至刻度，得濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。貯存于2～8 ℃冰箱中。

分別準(zhǔn)確移取10 μL各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用80%乙腈水稀釋并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 儀器條件

DART離子源條件設(shè)置：電離方式為正離子模式；離子化氣體為氦氣，壓力為0.55 MPa；待機(jī)氣體為氮?dú)?，壓力?.30 MPa；進(jìn)樣模式為12-Dip-it模式；離子源出口至質(zhì)譜進(jìn)口距離為2.40 cm；樣品傳輸速率為0.20 mm/s；離子化溫度為400 ℃；柵極電壓為400 V。

Exactive條件設(shè)置：電離方式為正離子模式；離子傳輸管溫度為250 ℃；掃描方式為Full MS/ddMS2；一級(jí)掃描范圍：m/z100～1 000；一級(jí)掃描分辨率70 000；AGC target：1e6；Maximum IT：100 ms；二級(jí)掃描分辨率：17 500；AGC target：1e5；Maximum IT：50 ms；NCE：20 eV、40 eV、60 eV。

1.3.3 前處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱取混勻后的保健酒樣品1 g（精確至0.01 g）于50 mL容量瓶中，加適量80%乙腈水溶液，渦旋混勻，超聲15 min，放冷至室溫，用80%乙腈水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，供DART-Q-Orbitrap HRMS檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品傳輸速率

本試驗(yàn)將樣品傳輸速率分別設(shè)置為0.2 mm/s、0.3 mm/s、0.4 mm/s、0.5 mm/s和0.6 mm/s，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。樣品傳輸速率在0.2～0.6 mm/s范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著樣品傳輸速率的增大逐步降低。這是因?yàn)闃悠穫鬏斔俾试酱螅繕?biāo)化合物與離子化氣體接觸越不充分，離子化效率較低，離子響應(yīng)強(qiáng)度也隨之降低。因此，綜合離子響應(yīng)強(qiáng)度、峰形等因素，最終選擇樣品傳輸速率為0.2 mm/s。

2.2 離子化溫度

本試驗(yàn)以50 ℃為步長(zhǎng)，在250～550 ℃范圍內(nèi)，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。在250～400 ℃范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)溫度高于400 ℃后，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著離子化溫度的升高而降低。因此，最終選擇400 ℃作為離子化溫度。

2.3 柵極電壓

本試驗(yàn)考察柵極電壓在250～500 V范圍內(nèi)，以50 V為步長(zhǎng)，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。在250～400 V范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著柵極電壓的增大而增強(qiáng)；當(dāng)柵極電壓大于400 V后，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著柵極電壓的增大而降低。因此，最終柵極電壓選擇為400 V。

2.4 定性過程

LC-MS/MS法通常利用保留時(shí)間、離子對(duì)豐度比等信息進(jìn)行定性，而Q-Orbitrap HRMS測(cè)得的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)即可作為定性的依據(jù)[6]。12種PDE5抑制劑的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)理論值與試測(cè)值之間的相對(duì)質(zhì)量偏差在0.02～1.89 ppm范圍內(nèi)，均小于5.0 ppm，滿足定性需求。本研究同時(shí)采集了二級(jí)特征碎片離子信息，通過一級(jí)質(zhì)譜信息與二級(jí)特征碎片離子信息相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定性。12種PDE5抑制劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 12種PDE5抑制劑的質(zhì)譜分析參數(shù)表

（續(xù)表1）

2.5 檢出限

通過在空白保健酒基質(zhì)中添加不同濃度水平的12種PED5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各個(gè)物質(zhì)的檢出限。如表2所示，12種PDE5抑制劑檢出限在0.03～2.50 mg/kg范圍內(nèi)，滿足篩查的需求。

表2 12種PDE5抑制劑的檢出限

2.6 市售樣品的檢測(cè)

采用本文建立的方法對(duì)市售的10批次保健酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)樣，采用一級(jí)提取離子圖和一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)對(duì)樣品中可能添加的12種PDE5抑制劑進(jìn)行初步定性篩查，若出現(xiàn)可疑樣品，結(jié)合二級(jí)特征碎片離子進(jìn)行進(jìn)一步確證。篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)1批次鹿尾巴酒為西地那非陽性樣品。采用國(guó)家現(xiàn)行食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法--BJS 201805 食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定（第一法）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該批次鹿尾巴酒為西地那非陽性樣品，含量為681 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究將DART與Q-Orbitrap HRMS兩者優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準(zhǔn)定性的檢測(cè)方法。該方法無需色譜分離過程，分析速度快，有機(jī)試劑消耗量少，綠色環(huán)保。此外，Q-Orbitrap HRMS通過一級(jí)全掃描獲得12種PDE5抑制劑的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)，同時(shí)以數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描模式獲得的二級(jí)特征質(zhì)譜信息為基礎(chǔ)，構(gòu)建了12種PDE5抑制劑質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，此數(shù)據(jù)庫(kù)作為自建數(shù)據(jù)庫(kù)可不斷擴(kuò)充，為實(shí)現(xiàn)保健酒中非法添加化學(xué)藥物的快速篩查和精準(zhǔn)定性提供數(shù)據(jù)支撐。本方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性，為維護(hù)保健酒行業(yè)的健康發(fā)展和保障我國(guó)食品安全提供技術(shù)支持。