歐陽曉倫，劉嘉樂，鞏光祿，申貴男，袁媛，高亞梅，晏磊，王偉東，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）是銀杏屬的一種落葉樹，又名公孫樹等。銀杏葉是地球上最古老的植物之一，可以追溯到2億多年前。銀杏通常視為藥用植物，其種子、葉片和果實(shí)可用于抗菌、抗氧化、抗心血管疾病等生物活性藥物。但銀杏生長(zhǎng)緩慢，在自然條件下，從種植到結(jié)果需要20年以上的時(shí)間，這是銀杏產(chǎn)品發(fā)展的制約因素[1-2]。銀杏在生長(zhǎng)的過程中幾乎不會(huì)感染病原菌或者遭遇蟲害，與其自身和內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有著密不可分的關(guān)系。植物內(nèi)生菌是指其生活史的部分或全部階段存在于植物的各種器官、組織以及細(xì)胞間隙內(nèi)，同時(shí)宿主植物一般不表現(xiàn)出外在感染癥狀的一類微生物，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。植物內(nèi)生菌在寄主植物的生長(zhǎng)和系統(tǒng)進(jìn)化過程中起著重要的作用，在宿主整個(gè)生命過程中，植物內(nèi)生菌既能保護(hù)寄主不受病害，也幫助寄主在不利的環(huán)境中生存[3]。由于寄主植物與相關(guān)內(nèi)生菌的獨(dú)特關(guān)系，銀杏內(nèi)生菌是多種具有抗癌、抗菌等生物活性的新型次生代謝產(chǎn)物的重要來源。植物內(nèi)生菌所會(huì)產(chǎn)生的一系列化合物可能成為制藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)的潛在資源。

微生物次生代謝物為藥品的合成開發(fā)提供了豐富的前體化合物及合成途徑。Stierle等[4]于短葉紫杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離出的一株內(nèi)生真菌安德烈亞紫杉霉（Taxomyces andreanae）其培養(yǎng)液中能檢測(cè)出紫杉醇以及其他紫杉烷類化合物。從此，越來越多植物內(nèi)生菌從藥用植物如喜樹、松樹和桃兒七中分離出來[5-6]。從銀杏的根、莖、葉、種子和樹皮中分離到多種植物內(nèi)生菌，包括毛霉、曲霉、鏈格孢霉、青霉等，其產(chǎn)生大量的黃酮類、萜類和其他化合物[7-8]。這些具有生物活性的代謝產(chǎn)物對(duì)藥物前體開發(fā)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)具有吸引力。近年來，隨著農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域市場(chǎng)的要求，植物內(nèi)生菌作為新型藥物來源以及生防資源展現(xiàn)出巨大的潛力。

對(duì)近些年關(guān)于銀杏內(nèi)生菌及其與宿主植物相同、相似的活性代謝物和一些具有特殊骨架的活性代謝物的研究進(jìn)展加以總結(jié)，為研究者進(jìn)行相關(guān)科研試驗(yàn)提供參考。

1 銀杏內(nèi)生菌多樣性

銀杏中含有豐富的內(nèi)生菌種群，現(xiàn)已有超過30種不同的內(nèi)生菌在銀杏中被發(fā)現(xiàn)，如鏈格孢屬（Alternaria sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、毛殼菌屬（Chaetomium sp.）、炭角菌（Xylaria sp.）、多節(jié)孢屬（Nodulisporium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、麝香霉屬（Muscodor sp.）、小帚梗柱孢屬（Cylindrocladiella sp.）、小脆柄菇屬（Psathyrella sp.）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia sp.）等。總的來說，這些菌屬中的許多種從其他植物中也有分離[9-10]。銀杏內(nèi)生菌分離鑒定的焦點(diǎn)常在于能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的菌種上，且已分離鑒定的銀杏內(nèi)生菌以真菌為主。如Ye等[11]從銀杏葉中分離了80種內(nèi)生真菌，對(duì)能產(chǎn)生黃柄曲霉素的菌株Chaetomium CDW7進(jìn)行了詳細(xì)的研究，結(jié)果表明，其產(chǎn)生的黃柄曲霉素有極強(qiáng)的抗氧化能力，同時(shí)，分離出的裂褶菌屬（Schizophyllumsp.）、毛殼菌屬、青霉菌屬、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis.sp.）、毛盤孢屬（Colletotrichumsp.）可能有一定的抗氧化能力。Cui等[27]從銀杏根皮中分離出27株銀杏內(nèi)生菌，從中獲得了一株能產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B（Ginkgolide B）的內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）。近年來，隨著分子鑒定工具的成熟，通過ITS、rDNA的LSU、SSU部分序列和TEF1等技術(shù)，銀杏中一些獨(dú)有的新種陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，特別是相對(duì)較難以分離的內(nèi)生細(xì)菌。如Zhang等[15]在銀杏枝干中分離出一株新的銀杏內(nèi)生菌Pseudochaetosphaeronema ginkgonissp.；Yan等[16]在銀杏種子的銀杏內(nèi)生菌Streptomyces ginkgonis sp.nov.。Xu等[17]在銀杏根部分離出一株革蘭氏陽性，好氧的，菌落呈黃色且不產(chǎn)生孢子的放線菌，確定其為諾卡氏菌屬（Nocardioidessp.）的一個(gè)新種，命名為Nocardioides ginkgobilobaesp.。

在銀杏個(gè)體中，在不同器官和季節(jié)中內(nèi)生菌的組成有著明顯的數(shù)量和種類差異。內(nèi)生真菌中的擬莖點(diǎn)霉屬和莖點(diǎn)霉屬（Phyllostictasp.）是最容易分離的兩個(gè)屬，因此被認(rèn)為是占優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生菌。這兩種優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌的分布具有組織器官特異性，且在不同季節(jié)內(nèi)存在差異。擬莖點(diǎn)霉屬占細(xì)枝上內(nèi)生菌的84.8%，而在葉中和葉柄中分別占16.1%和24.3%。莖點(diǎn)霉屬則在葉中內(nèi)生菌的組成中占據(jù)72.9%，葉柄中次之，占65.7%，而細(xì)枝中未有發(fā)現(xiàn)。葉、葉柄和細(xì)枝這三個(gè)部位內(nèi)生真菌種群的時(shí)間變化表明，莖點(diǎn)霉屬于8月開始出現(xiàn)在葉和葉柄中，并在10月到達(dá)數(shù)量的峰值，而擬莖點(diǎn)霉屬在銀杏整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)都能被分離出來。這說明了這兩種優(yōu)勢(shì)菌不但具有組織器官特異性，而且存在著季節(jié)的差異[12-13]。Kumar等[14]的研究表明，樹齡和生長(zhǎng)環(huán)境的差異是影響銀杏根部?jī)?nèi)生菌群落組成的兩個(gè)重要因素。利用植物內(nèi)生菌的組成隨個(gè)體的地理位置、季節(jié)和植物組織器官的變化特點(diǎn)，有望提高銀杏內(nèi)生菌分離的種類和數(shù)目。

綜上所述，研究者對(duì)有顯著活力的銀杏內(nèi)生菌進(jìn)行了種屬的確定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及產(chǎn)物的分析等方面研究，而對(duì)于其他暫時(shí)沒能表現(xiàn)活性和具有潛在價(jià)值的內(nèi)生菌，常是被忽略。同時(shí)，銀杏內(nèi)生菌的群落組成受到了地理位置，季節(jié)氣候和銀杏樹齡等多種因素的影響，銀杏中不同的組織器官上優(yōu)勢(shì)菌群和功能菌群也有所差異。因此，在對(duì)銀杏內(nèi)生菌進(jìn)行研究時(shí)，綜合考慮影響銀杏內(nèi)生菌多樣性的因素，不僅能更加有效便捷的篩選出優(yōu)勢(shì)菌或功能菌，而且能提高所分離的銀杏內(nèi)生菌多樣性。

2 銀杏內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物

2.1 黃酮類化合物

抗氧化是預(yù)防衰老的重要途徑，對(duì)于一些由于自身自由基引起的老化相關(guān)疾病，如果能夠消除過多的氧化自由基預(yù)防相關(guān)疾病，意義是相當(dāng)重要的。黃酮類化合物多具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)食品防腐、抗腫瘤和減緩衰老等有著較好的作用。銀杏內(nèi)生菌能產(chǎn)生黃酮類化合物，并在抗氧化的試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。YX-28是一株由Liu等[18]從銀杏的細(xì)枝上分離的內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定為炭角菌屬（Xylariasp.），采用不同溶劑對(duì)其發(fā)酵液的成分進(jìn)行提取，結(jié)果表明，在1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和β-胡蘿卜素-亞油酸的抗氧化試驗(yàn)中，其甲醇提取液展示出顯著的抗氧化活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其甲醇提取液中含有豐富的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，其中總黃酮類物質(zhì)的含量達(dá)到86.76 mg·g-1，是其具有顯著抗氧化活性的主要原因。曲霉菌屬（Aspergillussp.）中的大多數(shù)種常引起植物腐敗和枯萎，而Yan等[34]在銀杏中分離的YXf3既能產(chǎn)生一系列的萜類物質(zhì)，還能產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)，其中包括黃酮醇（Chlorflavonin）及其新的衍生物-黃酮醇A（ChlorflavoninA）。同樣，Qiu等[20]在銀杏的細(xì)枝中分離得到內(nèi)生菌ST22和SX10，通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡的形態(tài)學(xué)鑒定表均為曲霉屬（Aspergillus），通過分子工具進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ST22被鑒定為構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans），SX10則為米曲霉（Aspergillus oryzae）。ST22和SX10非但未在銀杏上表現(xiàn)出病害特征，且能夠產(chǎn)生具有良好抗氧化活性的黃酮醇，它們的總黃酮產(chǎn)量分別為0.011 62±0.001 4 mg·mL-1和0.012 56±0.003 78 mg·mL-1?？寡趸囼?yàn)表明，ST22抗氧化能力為34.17%，SX10抗氧化能力為58.71%。ST22和SX10生產(chǎn)的總黃酮量和展現(xiàn)出較好的抗氧化能力，使其有望成為抗氧化活性劑生產(chǎn)的潛在資源。Pan等[19]從銀杏種子中分離出內(nèi)生真菌-白黃小脆柄菇（Psathyrella candolleana），其 能 產(chǎn) 生 槲 皮 素（Quercetin），對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的最低抑菌濃度為0.390 6 mg·mL-1，顯示出較好的抑制作用。黃酮醇、黃酮醇A及槲皮素的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的黃酮類化合物Fig.1 Flavonoids produced by ginkgo endophytes

2.2 抗菌脂肽

抗菌脂肽是由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）以及納豆菌（Bacillus natto）等為代表的芽孢桿菌產(chǎn)生的一系列脂肽類物質(zhì)，通常有表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、芬薺素（Fengycin）和枯草菌素（Subtilin）等，其分子通常以環(huán)脂肽的結(jié)構(gòu)存在[32，35]?？咕脑诃h(huán)境治理和醫(yī)藥上上有著抗菌譜廣、耐藥性低、無殘余毒害作用等優(yōu)點(diǎn)。

Yang等[21]從銀杏葉中分離到的Fy11和Zy44（Bacillus amyloliquefaciens）兩株內(nèi)生細(xì)菌，兩株內(nèi)生細(xì)菌的混合使用能有效的抑制辣椒疫病，其中Zy44所產(chǎn)生的粗脂肽起著主要作用。試驗(yàn)中將辣椒疫霉（Phytophthora capsici）接入到3周大的辣椒苗上，于疫霉接種第7天和第15天接入Fy11和Zy44的混合菌劑，防治效果分別達(dá)到84.8%和67.2%。毛色二孢屬（Lasiodiplodiasp.）是一類引起林木色變的重要病原菌，Yuan等[22]從銀杏中分離到一株解淀粉芽孢桿菌CGMCC 5569，其發(fā)酵液其對(duì)Lasiodiplodia rubropurpurea、L.crassispora和L.theobromae等引起林木變色的病原菌，均有較強(qiáng)的體外生長(zhǎng)抑制作用，抑制率分別為70.22%、69.53%和78.76%。進(jìn)而利用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取，得到了一系列的抗真菌的脂肽，成分分析表明其中包括表面活性素、桿菌霉素（Bacillomycin）和芬薺素（表面活性素、桿菌霉素和芬薺素的結(jié)構(gòu)如圖2所示），解淀粉芽孢桿菌CGMCC 5569及其生物活性成分可能為林木變色病原真菌的生物防治提供新的生物資源。

圖2 銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的粗脂肽Fig.2 Crude lipopeptide produced by ginkgo endophyte

2.3 球毛殼菌素（chaetoglobosins）

球毛殼菌素（chaetoglobosins）是一類通常由球毛殼菌（Chaetomium globosum）產(chǎn)生細(xì)胞松弛素，能與細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合，從而達(dá)到抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)。球毛殼菌素在癌癥治療和植物病害防治等領(lǐng)域，是天然的、具有潛力的和有效的化合物[23]。從銀杏中分離的內(nèi)生真菌Chaetomium globosumNo.04的發(fā)酵液中分離純化了6種生物堿，并鑒定出其結(jié)構(gòu)為Chaetoglobosin A、C、D、E、G、R，進(jìn)而在對(duì)匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）兩種植物病原菌的抑菌試驗(yàn)中，這6種生物堿活性濃度為20 μg·disc-1時(shí)，顯著抑制了匍枝根霉和葡萄白腐病菌的生長(zhǎng)，說明內(nèi)生真菌Chaetomium globosumNo.04對(duì)匍枝根霉和葡萄白腐病菌的強(qiáng)效抗菌活性[24]。Xue等[25]也從銀杏葉中分離出的球毛殼菌的發(fā)酵液中分離得到ChaetoglobosinVb，ChaetoglobosinV和ChaetoglobosinG。ChaetoglobosinV和ChaetoglobosinG在對(duì)番茄早疫病菌（Alternaria solani）的抑菌試驗(yàn)中表現(xiàn)出有明顯的抑菌活性，測(cè)定后其最低抑菌濃度為25 mg·mL-1；ChaetoglobosinV和ChaetoglobosinG對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereusiand）和銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也有一定的抑菌活性。Chaetoglobosin Vb沒有表現(xiàn)出任何活性，與Chaetoglobosin V相比，其C-17和C-21有不同構(gòu)型，但是Chaetoglobosin Vb，Chaetoglobosin V和Chaetoglobosin G三者能在球毛殼菌（Chaetomium globosum）內(nèi)相互轉(zhuǎn)化。文中提及的球毛殼菌素的結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3 銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的球毛殼菌素Fig.3 Chaetoglobosins produced by ginkgo endophytes

2.4 其它產(chǎn)物

銀杏內(nèi)酯類是在銀杏提取物中重要的功效組分之一，其中的銀杏內(nèi)酯B（Ginkgolide B）是血小板活化因子拮抗劑，可在臨床上用于治療血栓、急性胰腺炎和心血管疾病，還可用于轉(zhuǎn)移性癌癥的治療，對(duì)損傷神經(jīng)元也有保護(hù)作用，同時(shí)具有抗氧化，延緩衰老的作用。白果內(nèi)酯（Bilobalide）是一種有神經(jīng)保護(hù)作用的三萜內(nèi)酯。Qian等[26]從銀杏葉中分離到一株產(chǎn)白果內(nèi)酯的內(nèi)生真菌GZUYX13，經(jīng)鑒定為Pestalotiopsis uvicolavia。該菌株在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生白果內(nèi)酯，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，其產(chǎn)生白果內(nèi)酯的量為106 μg·L-1。Cui等[27]在銀杏根皮中篩選出內(nèi)生真菌SY0056，經(jīng)鑒定其為Fusarium oxysporum，其在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)后，通過HPLC/ESI-MS和13C-NMR等技術(shù)從其代謝產(chǎn)物中分離出銀杏內(nèi)酯B。綜上所述，通過篩選培養(yǎng)產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B的內(nèi)生真菌，可能解除從銀杏葉以及銀杏樹皮中提取銀杏內(nèi)酯B的資源限制。

銀杏內(nèi)生菌中的部分種屬能產(chǎn)生豐富的萜類物質(zhì)，其可能具有多種生物活性。Wu等[28]在銀杏的葉、細(xì)枝和根部分離出多株內(nèi)生真菌，其中SYPF 7131鑒定為Penicillium cataractum，其產(chǎn)生的青霉烯內(nèi)酯A（Penicimenolidyu A）、青霉烯內(nèi)酯B（Penicimenolidyu B）及Rasfonin對(duì)金黃色葡萄球菌的絲狀溫敏蛋白（FtsZ）的產(chǎn)生有抑制作用，尤其是Rasfonin，最低抑菌濃度為10 μg·mL-1。YXf3是從銀杏葉中分離出的內(nèi)生曲霉菌（Aspergillussp.），Guo和Yan[29-31]等先后報(bào)道了從YXf3的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了多種萜類物質(zhì)Aspergiloid。其 中Aspergiloid A、Aspergiloid B、Aspergiloid C、Aspergiloid D和Aspergiloid I具有多種生物活性，包括細(xì)胞毒性、抗菌活性，但Aspergiloid E-H雖均未發(fā)現(xiàn)出抗菌活性或細(xì)胞毒性等生物活性，但其能作為化學(xué)轉(zhuǎn)化合成其他Aspergiloid及其衍生物的前體物質(zhì)。Aspergiloid、銀杏內(nèi)酯和青霉烯內(nèi)酯A等化合物結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖4 銀杏內(nèi)生菌的其他產(chǎn)物Fig.4 Other products of ginkgo endophytes

3 結(jié)論

地球是一個(gè)巨大生物資源庫，其有植物種類約27萬種，以每種植物中分離獲得約4種特有的植物內(nèi)生菌計(jì)算，可分離獲得內(nèi)生菌的數(shù)量將超過100萬種[33]。內(nèi)生菌的研究開辟了微生物應(yīng)用研究的新領(lǐng)域，目前工作的重點(diǎn)是篩選能產(chǎn)生與寄主相同或相似次生代謝產(chǎn)物的菌株，經(jīng)育種改造菌株或改進(jìn)工藝，利用其工業(yè)化生產(chǎn)新型的化合物，以應(yīng)用于、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[34]。由此可見，利用植物內(nèi)生菌獲得有效活性物質(zhì)來替代對(duì)宿主植物自身的利用，能夠打破某些植物資源生長(zhǎng)周期長(zhǎng)或不可再生等制約條件，有望成為獲得有效活性物質(zhì)的一種新的手段，具有極大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。

概述了銀杏內(nèi)生菌有潛力被開發(fā)為生物農(nóng)藥、醫(yī)藥或醫(yī)藥前體，這些次級(jí)代謝物具有廣泛的活性，包括抗菌、抗氧化和生物防治等。同時(shí)，銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的生物活性次生代謝產(chǎn)物合成了新藥的機(jī)會(huì)，因?yàn)槲磥淼男滤幬镄枰碌幕瘜W(xué)骨架作為合成的基礎(chǔ)，甚至是新的化學(xué)骨架可作為前體合成新藥，新藥的創(chuàng)造與合成則可能為人類未來治愈更多疾病提供有效的途徑。

4 展望

如今，從銀杏葉中分離出的大多數(shù)內(nèi)生菌仍未對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。一般而言，銀杏內(nèi)生菌值得結(jié)合形態(tài)學(xué)，化學(xué)分類學(xué)和基于多位點(diǎn)的分子系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行研究。這種結(jié)合的方法學(xué)可以發(fā)現(xiàn)許多具有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的化合物。

植物內(nèi)生菌是多種微生物構(gòu)成的微生物群體，而且大多數(shù)植物內(nèi)生菌仍然未被有效分離，植物內(nèi)生菌的起源分子機(jī)理不清楚，植物內(nèi)生菌的作用機(jī)理不清楚以及植物內(nèi)生菌作為生防因子無法實(shí)際應(yīng)用，不同生長(zhǎng)時(shí)期需要怎樣的群落以及何時(shí)對(duì)植物作用都不清楚等。因此，更深入的探究銀杏內(nèi)生菌和銀杏之間的關(guān)系，了解銀杏樹內(nèi)生菌的分布和種群結(jié)構(gòu)模式可有助于有效探索植物內(nèi)生菌，以從其他植物中分離出具有獨(dú)特生物效益和經(jīng)濟(jì)效益的植物內(nèi)生菌[12]?？傮w而言，未來的研究應(yīng)重視植物內(nèi)生菌的起源和植物內(nèi)生菌的作用機(jī)理，將傳統(tǒng)培養(yǎng)和非傳統(tǒng)培養(yǎng)的方式結(jié)合起來，動(dòng)態(tài)追蹤植物內(nèi)生菌的定殖與生長(zhǎng)，以便研究植物內(nèi)生菌的起源及其作用機(jī)理。隨著植物內(nèi)生菌研究的深入及其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，必將給人類帶來更多的利益，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。