高珊，張金艷，矯月，周暢，紀(jì)德清，李文欣

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)理學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院）

黑曲霉是半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科，是絲狀真菌的一個(gè)常見(jiàn)品種，廣泛分布于全國(guó)各地的糧食、植物產(chǎn)品和土壤中，可應(yīng)用于生產(chǎn)有機(jī)酸[1]、加工酶制劑[2]和進(jìn)行污水處理[3]等方面。其中還含有針對(duì)植物學(xué)原料的幾乎全套的分解酶，包括淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木質(zhì)素過(guò)氧化酶[4]、阿魏酸酯酶[5]和錳過(guò)氧化酶[6]等，對(duì)植物性原料能夠進(jìn)行全面協(xié)同的分解。由于黑曲霉生長(zhǎng)旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素，被美國(guó)FDA認(rèn)證為安全菌種（GRAS）[7]。

地膜按照材料特性分為不可降解地膜和可降解地膜。不可降解地膜是在主要原料為聚乙烯中加入各種添加劑混合制成；可降解地膜是在一段時(shí)間內(nèi)，利用微生物的生理活動(dòng)、物質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)以及紫外照射來(lái)相互協(xié)同、增效，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)污染降解的一類地膜[8]。聚乙烯是乙烯通過(guò)聚合制得的一種熱塑性樹(shù)脂，是國(guó)內(nèi)樹(shù)脂合成中進(jìn)出口量最多、產(chǎn)出量最大的品種及五大合成樹(shù)脂之一，其密度約為0.92 g·cm-3左右，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，并且不溶于水，不容易被酶和微生物降解。聚乙烯主要分為高密度聚乙烯（HDPE）、低密度聚乙烯（LDPE）、線性低密度聚乙烯（LLDPE）3類[9]?，F(xiàn)階段農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的地膜大多數(shù)為不可降解的聚乙烯地膜，廣泛用于作物的覆蓋，覆蓋面積可達(dá)千萬(wàn)公頃以上，可用于小麥、棉花、木耳、土豆、西瓜、藥物和茶葉等40余種農(nóng)作物，使農(nóng)作物產(chǎn)量增加30%~50%，價(jià)值增加40%~60%[10]。但聚乙烯地膜耐低溫、耐腐蝕、分子結(jié)晶度高、難降解，在環(huán)境中它會(huì)裂為小碎片殘留于土壤，引起土壤板結(jié)，降低糧食產(chǎn)量[11]。廢棄的聚乙烯地膜碎片還容易在空中漂浮，造成環(huán)境污染。因此，將農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廢棄的地膜及時(shí)處理亟待解決。目前廢棄的聚乙烯地膜只是由農(nóng)戶交至回收網(wǎng)點(diǎn)再利用[12]，這種處理方式治標(biāo)不治本，增加農(nóng)民的負(fù)擔(dān)和農(nóng)業(yè)成本。很多研究人員都致力于尋找降解廢棄地膜的方法，近幾年，開(kāi)發(fā)了可降解的地膜，但也只是局限于科學(xué)研究和局部使用，大范圍應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的不多。因此，目前主要采用的方法仍是將廢棄的普通聚乙烯地膜進(jìn)行降解，地膜降解后碳鏈將發(fā)生斷裂，使碳原子數(shù)減少，從而加速土壤微生物對(duì)其降解，減輕地膜對(duì)土壤和環(huán)境的污染。然而，在自然條件下，普通的聚乙烯地膜降解過(guò)程非常漫長(zhǎng)，甚至需要幾百年[13]。而黑曲霉具有生長(zhǎng)旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素、無(wú)污染等特點(diǎn)，對(duì)煙嘧磺隆[14]、赤霉酸[15]、酒石酸[16]、有機(jī)磷農(nóng)藥氧樂(lè)果[17]、黃曲霉毒素[18]、人參皂苷Rb1[19]等都具有降解能力。雖然國(guó)內(nèi)外只有利用黑曲霉降解小分子化合物的研究，降解高分子樹(shù)脂類的研究未見(jiàn)報(bào)道。但基于黑曲霉在生物工業(yè)上具有裂解高分子有機(jī)物的作用[20]，研究嘗試探索利用黑曲霉降解高分子化合物聚乙烯地膜，來(lái)減輕農(nóng)用廢棄地膜對(duì)土壤和環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

蛋白胨、硫酸氫二鉀、酵母浸出粉、硫酸鎂、葡萄糖均購(gòu)自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，純度為分析純；黑曲霉購(gòu)自沂水錦潤(rùn)生物科技有限公司；聚乙烯地膜為吉林省蛟河市漂河鎮(zhèn)炳龍家庭農(nóng)場(chǎng)當(dāng)年使用過(guò)的廢棄地膜；干燥土取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校內(nèi)。

MGC-300A光照培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DSX-24L高壓滅菌鍋購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；DZG-6050SA真空干燥箱購(gòu)自上海森信試驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 馬丁培養(yǎng)基的改良

將5.0 g蛋白胨、1.0 g磷酸氫二鉀、2.0 g酵母浸出粉、0.5 g硫酸鎂和1 000 mL水混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值約為6.8，煮沸。加入20.0 g葡萄糖溶解后，搖勻、過(guò)濾、分裝，高壓滅菌。

1.2.2 黑曲霉的活化

首先將市售的黑曲霉配成溶液（吸取滅菌后的馬丁培養(yǎng)基3~4 mL到培養(yǎng)皿上，再取2~3 g黑曲霉干粉放入其中，搖勻，使菌體溶解呈懸浮狀），然后在改良的馬丁培養(yǎng)基上加入1~2 mL黑曲霉液，放入光照強(qiáng)度為80%、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，使黑曲霉活化。

1.2.3 馬丁瓊脂培養(yǎng)基的制備及滅菌

在改良的馬丁培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂，加熱溶化后過(guò)濾、搖勻，調(diào)節(jié)pH值為6.4±0.2。然后將活化后的黑曲霉溶液加到培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基分別裝入錐形瓶，用報(bào)紙和線繩包扎好瓶口后編號(hào)，在121℃下滅菌20 min。

1.2.4 接種培養(yǎng)

把滅菌后的錐形瓶?jī)?nèi)的黑曲霉溶液全部轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，然后用滅菌后的接種環(huán)蘸取黑曲霉溶液在培養(yǎng)皿中劃線，蓋上培養(yǎng)皿蓋后放置20~30 min，使溶液滲透到培養(yǎng)基內(nèi)，放入37℃光照培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為80%，最后制得黑曲霉菌液。

1.2.5 地膜的降解

首先將制得的黑曲霉菌液取出5 mL，裝在噴霧瓶中，均勻噴灑到地膜上，然后取2 cm經(jīng)40目篩過(guò)篩后的干燥滅菌土壤將地膜埋上，無(wú)需密封。最后在黑曲霉最佳生長(zhǎng)條件下，將樣品放在溫度為37℃[21]、光照強(qiáng)度為80 %的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)26 d。同時(shí)，將沒(méi)有噴灑黑曲霉菌液的地膜作為對(duì)照處理。

1.2.6 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定方法

采用烏氏粘度計(jì)測(cè)粘度的方法分別測(cè)定黑曲霉液處理前后廢棄地膜的相對(duì)分子質(zhì)量[22]。

（1）將干凈的粘度計(jì)的B管和C管都接上短橡膠管，然后將其垂直放入30℃的水浴鍋中，水浸過(guò)F球。

（2）準(zhǔn)確稱量未處理的廢棄的地膜0.813 6 g，用80 mL甲苯在70℃的水浴上加熱30 min使其溶解，然后將地膜取出烘干，測(cè)其溶解地膜的質(zhì)量。同樣方法處理相同質(zhì)量的經(jīng)黑曲霉溶液處理后的地膜。

（3）溶液流出時(shí)間的測(cè)定

吸取甲苯、廢棄聚乙烯地膜混合溶液10 mL，由A管注入F球中，恒溫15 min，使溶液全部成分混合均勻。將C管完全夾緊使之密封，在B管處用一個(gè)洗耳球?qū)⑷咳芤航?jīng)F球、毛細(xì)管、E球抽至G球2/3處，打開(kāi)C管夾子，讓C管通入大氣，將G球內(nèi)的全部溶液倒流。此時(shí)毛細(xì)管內(nèi)的液體下落，當(dāng)液面流經(jīng)a刻度時(shí)，立即按計(jì)時(shí)表開(kāi)始記錄時(shí)間，當(dāng)液面降至b刻度時(shí)，再按計(jì)時(shí)表，測(cè)得刻度a、b之間的液體流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間。

（4）溶劑流出時(shí)間的測(cè)定

用蒸餾水洗滌黏度計(jì)，需要反復(fù)地清洗黏度計(jì)中的毛細(xì)管道。用水清洗1~2次，然后從A管中加入大約15 mL的水溶液。使用相同方法來(lái)檢測(cè)溶劑從空氣中流出的持續(xù)時(shí)間t0。

（5）計(jì)算地膜的相對(duì)分子質(zhì)量

增比粘度ηsp的計(jì)算公式為[23]：ηsp=ηr-1，其中ηr=t/t0，t和t0分別表示溶液流出時(shí)間和溶劑流出時(shí)間；

特性粘數(shù)[η]的計(jì)算公式為[23]：[η]=KMα

式中的K、ɑ、β是與聚合物、溶劑及溶液溫度等有關(guān)的常數(shù)，ηr是相對(duì)粘度，ηsp是增比粘度，c是溶液的濃度。

由ηsp/c及l(fā)nηr/c得到特性粘數(shù)值。

（6）計(jì)算地膜的降解率

1.2.7 聚乙烯地膜降解效果的評(píng)定

（1）觀察法。觀察地膜用黑曲霉液處理前后外觀的變化，初步判斷地膜是否被降解。

（2）相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定法。用測(cè)出的地膜相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)來(lái)判定被降解的效果。由于聚乙烯地膜是高分子化合物，沒(méi)有被降解的廢棄地膜相對(duì)分子質(zhì)量較大，被降解后地膜分子的鏈縮短，相對(duì)分子質(zhì)量減小。因此，用此方法可以準(zhǔn)確判定地膜被降解的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀察法研究黑曲霉對(duì)廢棄地膜的降解效果

將在干燥土壤中掩埋26 d后廢棄的聚乙烯地膜取出后洗干凈，外觀如圖1所示。其中，1號(hào)為沒(méi)有經(jīng)過(guò)黑曲霉液處理的土壤掩埋后的地膜，2號(hào)為經(jīng)過(guò)黑曲霉液處理的土壤掩埋后的地膜。

圖1 1為未經(jīng)黑曲霉溶液處理的廢棄地膜；2為經(jīng)黑曲霉溶液處理的廢棄地膜Fig.1 1 Aband waste plastic film treated without aspergillus niger solution；2 Aband waste plastic film treated with aspergillus niger solution

由圖1可以看出，同樣質(zhì)量的廢棄地膜經(jīng)黑曲霉液處理后，不僅大小發(fā)生很大變化，而且有明顯的收縮現(xiàn)象。這是因?yàn)榈啬け缓谇菇到夂笕芙庠谕寥乐校啬](méi)有被完全降解，還有部分地膜殘留在土壤中，使地膜變小和收縮。因此，初步推斷黑曲霉對(duì)地膜有一定的降解作用。

2.2 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定法研究黑曲霉對(duì)廢棄地膜的降解效果

雖然通過(guò)上述方法可以很直觀地看出黑曲霉對(duì)廢棄地膜的影響，但不能準(zhǔn)確判定地膜已經(jīng)被降解，而采用測(cè)定地膜相對(duì)分子質(zhì)量的方法可以明確判斷地膜是否被黑曲霉降解。因?yàn)榫垡蚁┑啬な歉叻肿踊衔?，被降解前后殘余地膜的相?duì)分子質(zhì)量是不同的。沒(méi)有被黑曲霉降解的地膜相對(duì)分子質(zhì)量較大，而地膜被降解后發(fā)生分子鏈的斷裂，相對(duì)分子質(zhì)量明顯減小。試驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量和降解率見(jiàn)表1和表2。

表1 溶液流出時(shí)間的測(cè)定Table 1 Determination of solution flow time

表2 未經(jīng)黑曲霉溶液處理地膜的ηsp/c，lnηr/c與c關(guān)系表Table 2 Relationship between ηsp/c，lnηr/c and c of mulch for treatment without Aspergillus niger solution

采用線性回歸函數(shù)預(yù)測(cè)ηsp/c和lnηr/c隨濃度變化情況，得到ηsp/c和lnηr/c的預(yù)測(cè)函數(shù)分別為：

計(jì)算得到ηsp/c和lnηr/c的預(yù)測(cè)值如表3所示：

表3 未經(jīng)黑曲霉溶液處理地膜的ηsp/c，lnηr/c與濃度線性回歸預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Prediction results of linear regression between ηsp/c，lnηr/c and concentration of mulch without treatment by Aspergillus niger solution

根據(jù)表3數(shù)據(jù)繪制ηsp/c和lnηr/c的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值折線圖（見(jiàn)圖2和圖3）：

圖2 未處理地膜的ηsp/c與濃度折線圖Fig.2 The fold line plot of ηsp/c versus concentration of untreated mulch

由表1可知t未處理>t處理，根據(jù)1.2.6（5）中公式可以推出η未處理>η處理，從而可以得出M未處理>M處理。聯(lián)合表1和表2可以計(jì)算出ηsp/c，lnηr/c與c的值，然后以溶液的濃度c為橫坐標(biāo)，以ηsp/c及l(fā)nηr/c為 縱坐標(biāo)做出ηsp/c-c及l(fā)nηr/c-c的關(guān)系圖，如圖3。再通過(guò)圖3回歸線方程計(jì)算出[η]，最后聯(lián)合表1，表2和圖3代入1.2.6（5）中公式計(jì)算出M未處理=4 321。

圖3 未處理地膜的lnηr/c與濃度折線圖Fig.3 The fold line plot of lnηr/c versus concentration of untreated mulch

同理，由表1和表3可以計(jì)算出ηsp/c，lnηr/c與c的值（見(jiàn)表4），進(jìn)一步得到經(jīng)黑曲霉溶液處理后ηsp/c和lnηr/c隨濃度變化值，利用線性擬合得到ηsp/c和lnηr/c的預(yù)測(cè)函數(shù)分別為：

表4 經(jīng)黑曲霉溶液處理地膜的ηsp/c，lnηr/c與c關(guān)系表Table 4 Relationship between ηsp/c，lnηr/c and c of treated mulch with Aspergillus niger solution

可計(jì)算得出ηsp/c和lnηr/c的預(yù)測(cè)值（見(jiàn)表5），根據(jù)表5繪制經(jīng)黑曲霉溶液處理后用濃度預(yù)測(cè)ηsp/c和lnηr/c的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值比對(duì)折線圖（見(jiàn)圖4和圖5）。

圖5 已處理地膜的lnηr/c與濃度折線圖Fig.5 The fold line plot of lnηr/c versus concentration of treated mulch

表5 經(jīng)黑曲霉溶液處理地膜的ηsp/c，lnηr/c與濃度線性回歸預(yù)測(cè)結(jié)果Table 5 Prediction results of linear regression between ηsp/c，lnηr/and c of treated mulch with Aspergillus niger solution

然后以溶液的濃度c為橫坐標(biāo)，以ηsp/c及l(fā)nηr/c為 縱坐標(biāo)做出ηsp/c-c及l(fā)nηr/c-c的關(guān)系圖，通過(guò)圖4計(jì)算出[η]，最后聯(lián)合表1，表3和圖4代入1.2.6（5）中公式計(jì)算出M處理=2 952。

圖4 已處理地膜的ηsp/c與濃度折線圖Fig.4 The fold line plot of ηsp/c versus concentration of treated mulch

根據(jù)測(cè)定后地膜的相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算出地膜的降解率如下：

從降解率可知，黑曲霉可以降解廢棄的聚乙烯地膜。

3 討論

從研究結(jié)果可以看出，黑曲霉溶液對(duì)廢棄的聚乙烯地膜產(chǎn)生了一定的降解作用，降解率可達(dá)到31.7%。目前利用黑曲霉液降解農(nóng)用廢棄聚乙烯地膜和采用相對(duì)分子量法測(cè)定地膜降解率來(lái)推斷地膜的降解效果等方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，而且，試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)影響黑曲霉活性的培養(yǎng)條件及對(duì)地膜降解的影響因素進(jìn)行深入地研究，尤其是降解時(shí)間非常短（27 d），因此，此降解率是否達(dá)到了最好的降解效果還有待于進(jìn)一步研究。而且，地膜降解后的產(chǎn)物是生成了二氧化碳還是乙烯也有待考證。

為了提高此方法的降解率和降解效果，今后將在以下幾個(gè)方面進(jìn)行深入研究：

（1）研究黑曲霉液的最佳培養(yǎng)條件，以及黑曲霉液濃度、降解溫度、光照強(qiáng)度和降解時(shí)間等對(duì)地膜降解效果的影響，尋找最佳降解條件；

（2）將廢棄的農(nóng)用地膜繼續(xù)進(jìn)行人工老化，研究黑曲霉液對(duì)不同老化程度地膜的降解效果；

（3）探究其他霉菌和黑曲霉一起聯(lián)合作用對(duì)地膜的降解效果；

（4）增加掃描電鏡的測(cè)定方法，通過(guò)觀察黑曲霉液對(duì)地膜結(jié)構(gòu)變化的影響研究地膜的降解效果。

4 結(jié)論

通過(guò)觀察法和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定法可以判定黑曲霉對(duì)廢棄地膜有降解效果，經(jīng)黑曲霉溶液處理過(guò)的土壤掩埋地膜后，地膜不僅變小和變軟，而且相對(duì)分子質(zhì)量由原來(lái)的4 321減小到2 952，降解率可達(dá)到31.7%。因此，可以利用黑曲霉溶液降解農(nóng)用廢棄的聚乙烯地膜，為治理白色污染提供了重要參考。