劉雯卿，陶浩，劉傳，毛一凡，石瑋

(皖南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除大量飲酒與其他因素以外[1]，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要的病理變化，導(dǎo)致終末期肝臟病變合并心血管和代謝疾病的最常見的臨床病理綜合征[2]。NAFLD可以繼續(xù)進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[3]。據(jù)報(bào)道，非酒精性脂肪性肝病在大多數(shù)西方國(guó)家人群中的患病率約達(dá)30%，國(guó)內(nèi)患病率也與之類似[4]，而且患病人群越來(lái)越趨于年輕化，這將給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。同時(shí)，NAFLD的持續(xù)存在以及嚴(yán)重程度也被證明是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，暫無(wú)理想有效的治療藥物，且單一的治療方式不佳。

NAFLD的治療目的在于降低胰島素抵抗水平以及氧化應(yīng)激水平，而二甲雙胍和維生素E作為副作用較小，效果較明顯的胰島素增敏劑與抗氧化劑，在眾多的試驗(yàn)和臨床中都有應(yīng)用[6]。本研究基于二甲雙胍和維生素E不同的藥理效應(yīng)，通過不同靶點(diǎn)聯(lián)合給藥，來(lái)探討二甲雙胍(MET)和維生素E(VE)聯(lián)合給藥的協(xié)同作用關(guān)系，以期為NAFLD的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只8周齡清潔型Wistar雌性大鼠，由皖南醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量(200±20)g，實(shí)驗(yàn)全程大鼠的處置完全遵守本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的準(zhǔn)則。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

普通飼料購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司；高脂乳劑由本實(shí)驗(yàn)組自行配制；分析天平(FA1104)購(gòu)自上海光正醫(yī)療器械有限公司；膽固醇(批號(hào)：20200513)、甘油三酯(批號(hào)：20200426)、低密度膽固醇(批號(hào)：20200516)、高密度膽固醇(批號(hào)：20200423)、超氧化物歧化酶(批號(hào)：20200323)及丙二醛(批號(hào)：20200516)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；微量移液器購(gòu)自德國(guó)艾本德股份公司；酶標(biāo)板快速孵育器(Thermo Fisher Scientific Oy，Multiskan GO 1510)；高速低溫離心機(jī)(X-30R)購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NAFLD大鼠模型建立與處理

50只Wistar雌性大鼠，標(biāo)準(zhǔn)飲水飲食，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d左右，將其隨機(jī)分為5組，每組各10只，分別標(biāo)記為對(duì)照組﹑高脂組﹑二甲雙胍治療組(MET組)、維生素E治療組(VE組)和二甲雙胍聯(lián)合維生素E治療組(聯(lián)合組)。5組大鼠全部采用基礎(chǔ)飼料足量喂養(yǎng)，除對(duì)照組以外，其余4組大鼠均采用自制的高脂乳劑(配方：復(fù)合維生素1.25 g+食用鹽(氯化鈉)、膽酸鈉、膽固醇各5 g+丙二醇15.55 g+吐溫80 18.2 g+奶粉40 g+白砂糖(蔗糖)75 g+蒸餾水150 g+玉米油200 g)灌胃，劑量為2 mL/(100 g·d)，每日1次。MET組灌含有二甲雙胍量為250 mg/(kg·d)，VE組灌含有250 mg/(kg·d)，聯(lián)合組灌含有二甲雙胍聯(lián)合維生素E制劑量均為250 mg/(kg·d)。每?jī)芍芊Q量1次大鼠體重，記錄數(shù)據(jù)變化。

1.3.2 肝體脂數(shù)

第10周末，用3%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，取肝臟稱重，并計(jì)算肝指數(shù)(%)= 肝重/大鼠體重 ×100%。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)

血脂四聯(lián)(TC、TG、HDL-C、LDL-C)檢測(cè)方法分別如下：大鼠第10周飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)集中處死后提取血清，直接法測(cè)量大鼠血清中高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，而甘油三酯和總膽固醇的檢測(cè)方法分別采用COD-PAP和CPO-PAP法。4項(xiàng)生化指標(biāo)全部按照試劑盒中的說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 抗氧化應(yīng)激指標(biāo)

超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。測(cè)定方法分別如下：大鼠第10周飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)集中處死后提取血清，采用直接法測(cè)量大鼠血清中 SOD和MDA。兩項(xiàng)指標(biāo)均根據(jù)試劑盒說(shuō)明書步驟加樣，在酶標(biāo)板快速孵育器上讀取檢測(cè)指標(biāo)的吸光度，分別計(jì)算兩者的含量。

1.3.5 大鼠肝臟樣品采集

第10周末大鼠集中處死后取肝臟，生理鹽水清洗后，將其固定于4%甲醛中用于伊紅美藍(lán)染色(HE染色)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的體重變化情況

第0、2、4、6、10周大鼠體重變化情況。經(jīng)單因素方差分析顯示，不同時(shí)間點(diǎn)大鼠體重變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 大鼠體重的變化(g)

2.2 大鼠肝指數(shù)測(cè)量結(jié)果

對(duì)照組肝指數(shù)最低為(2.91±0.24)%，聯(lián)合組肝指數(shù)最高為(3.69±0.32)%，各組間肝指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.46，P<0.001)。對(duì)照組與其他4組大鼠肝指數(shù)變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；MET組和聯(lián)合治療組大鼠肝指數(shù)變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)；VE組和MET組肝指數(shù)變化以及VE組和聯(lián)合組肝指數(shù)變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 大鼠肝指數(shù)的變化(%)

2.3 大鼠血脂生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

VE組TG含量最低為(0.67±0.086) mmol/L，高脂組TG含量最高為(0.85±0.11)mmol/L。高脂組LDL-C含量最低為(0.30±0.090)mmol/L，MET組LDL-C含量最高為(0.46±0.14)mmol/L。TC和HDL-C各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG和LDL-C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中TG濃度變化在高脂組、MET組及聯(lián)合組與VE組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LDL-C濃度變化在高脂組、聯(lián)合組及對(duì)照組與MET組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠血脂生化指標(biāo)的變化(mmol/L)

2.4 大鼠MDA的變化

VE組MDA最低為(0.17±0.09)nmol/mL，對(duì)照組MDA最高為(0.28±0.07)nmol/mL。VE組SOD最低為(90.69±4.23) U/mL，MET組SOD最高為(95.92±3.16)U/mL。具體來(lái)看：MDA的變化情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，聯(lián)合組和對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VE組分別與MET組和對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOD的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 大鼠MDA和SOD的變化

2.5 大鼠肝臟病理HE染色觀察

對(duì)照組A大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，索狀排列整齊，肝細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富；高脂組B和C大鼠肝細(xì)胞索排列明顯紊亂，且出現(xiàn)輕度彌漫性脂肪變，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不一、大小不等的脂滴空泡，將細(xì)胞核擠向細(xì)胞一側(cè)，見圖1。

A：對(duì)照組，B和C：高脂組

3 討 論

通過近年來(lái)研究的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，“二次打擊”是目前最為成熟的解釋NAFLD發(fā)病機(jī)制的學(xué)說(shuō)。由脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗所引起的脂質(zhì)堆積為“一次打擊”[7]，“二次打擊”是在“一次打擊”的基礎(chǔ)上，肝臟大量蓄積脂肪并發(fā)生氧化應(yīng)激或過氧化損傷而引起肝細(xì)胞炎癥、肝纖維化甚至肝硬化[8]。胰島素增敏劑能夠抵抗“一次打擊”，而抗氧化劑可以對(duì)抗“二次打擊”。本實(shí)驗(yàn)選取抵抗“一次打擊”藥物二甲雙胍和抵抗“二次打擊”藥物維生素E聯(lián)合給藥來(lái)探究對(duì)NAFLD的防治作用，具體討論情況如下所示。

3.1 大鼠體重及肝指數(shù)分析

從大鼠體重的增長(zhǎng)情況來(lái)看，5組大鼠體重都隨著時(shí)間慢慢增長(zhǎng)，但是各組大鼠體重的變化差異都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與多數(shù)高脂飲食喂養(yǎng)模型規(guī)律不一致[9-10]，可能是由于本實(shí)驗(yàn)采取誘導(dǎo)脂肪肝的方式是通過高脂乳劑進(jìn)行灌胃，雖然保證了每日的脂肪攝入量，但未能保證總熱能的高攝入。并且高脂乳劑的配方對(duì)大鼠體重影響也有一定時(shí)序性變化[10]642-647。高脂乳劑的灌胃很可能影響了大鼠對(duì)飼料的食用，因此本實(shí)驗(yàn)最終未能使實(shí)驗(yàn)組的體重高于對(duì)照組。

雖然體重增長(zhǎng)強(qiáng)度在不同時(shí)期未出現(xiàn)差異，但肝體指數(shù)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在差異(P<0.05)，提示本實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期效果。各實(shí)驗(yàn)組的肝指數(shù)均高于對(duì)照組，即大鼠肝臟脂質(zhì)明顯蓄積，很有可能加重了肝臟的脂肪變性，這與汪美汐[11]等研究的非酒精性脂肪性肝病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托纬蛇^程基本一致。說(shuō)明高脂乳劑灌胃雖然在增加大鼠體重方面表現(xiàn)不太理想，但是在誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生上具有一定的促進(jìn)作用。VE組、MET組以及聯(lián)合治療組和高脂組之間肝指數(shù)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示該模型可能具有較長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期的特征，故用藥治療組可能并未達(dá)到預(yù)期療效。而肝指數(shù)在MET組和聯(lián)合組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示單一給藥與聯(lián)合用藥之間是有一差異的，但是MET組干預(yù)效果明顯優(yōu)于聯(lián)合組，表明可能是由于VE和MET的劑量配比可能存在一定的缺陷，仍需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索最佳的劑量組合。

3.2 大鼠血脂指標(biāo)分析

從大鼠血清各項(xiàng)生化指標(biāo)來(lái)看，研究發(fā)現(xiàn)各組之間TC和HDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而TG和LDL-C差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

有文獻(xiàn)[12]表明，TG與LDL-C的異常升高有助于NAFLD的進(jìn)展。VE組較高脂組的TG含量明顯降低，提示維生素E可以有效改善肝臟脂代謝狀況，這與馬小珺[13]等人的研究一致，此外Sato K等人所作的Meta分析，認(rèn)為維生素E可以有效改善肝功能，減輕脂肪變性和炎癥性損傷，為維生素E在NAFLD防治應(yīng)用中提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[14]。TG含量在MET組和聯(lián)合組與VE組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，暗示用二甲雙胍治療后，肝臟脂代謝無(wú)明顯改善，說(shuō)明MET在改善TG方面無(wú)優(yōu)勢(shì)，這與Said A[15]等經(jīng)過Meta分析指出的結(jié)果以及駱菁怡[6]1319-1324等的研究基本一致。有大量臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)及薈萃分析顯示，NAFLD患者應(yīng)用于二甲雙胍雖然可以提高胰島素敏感性，改善體重指數(shù)、血清甘油三酯及膽固醇水平，但是并不能有效改善其肝臟組織學(xué)情況[15]538-547。

聯(lián)合組較MET組LDL-C含量明顯降低，提示VE和MET在不同靶點(diǎn)之間的作用具有協(xié)同關(guān)系，即兩種藥物聯(lián)合治療效果要優(yōu)于MET單獨(dú)給藥治療，這與陳彩云[16]等研究的聯(lián)合用藥機(jī)制所得出的結(jié)論基本一致。

3.3 大鼠抗氧化應(yīng)激指標(biāo)分析

從大鼠MDA和SOD變化情況來(lái)看：SOD主要作用是清除體內(nèi)自由基，可以和MDA聯(lián)合反應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。本實(shí)驗(yàn)SOD沒有差異，可能是由于SOD不穩(wěn)定，極容易降解，沒有及時(shí)檢測(cè)，造成效果不佳，但是P值接近0.05，在重復(fù)實(shí)驗(yàn)再次進(jìn)行測(cè)量時(shí)，可能會(huì)得到差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。需要在下一次的實(shí)驗(yàn)中及時(shí)檢測(cè)該指標(biāo)。同時(shí)也有文獻(xiàn)提示長(zhǎng)期大劑量補(bǔ)充維生素E(≥400 IU/d)可能會(huì)誘發(fā)促氧化反應(yīng)[17]，因此也可能是上述原因?qū)е耂OD檢測(cè)各組間無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)表明VE組較MET組以及對(duì)照組MDA含量明顯降低，說(shuō)明MDA作為脂質(zhì)氧化后的終產(chǎn)物，可以有效減輕脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)肝臟，并且VE效果優(yōu)于MET。而聯(lián)合組與對(duì)照組之間相比較，MDA濃度也大大降低，表明采用MET和VE不同靶點(diǎn)聯(lián)合給藥時(shí)，二者不會(huì)相互影響，聯(lián)合作用途徑可以推廣，這與廖曉輝[18]等人的研究結(jié)果基本一致。

臨床治療過程中非酒精性脂肪性肝病尚無(wú)明顯有效的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，而針對(duì)不同靶點(diǎn)的多種藥物聯(lián)合干預(yù)方法將是未來(lái)研究的方向。本次實(shí)驗(yàn)雖然二甲雙胍的干預(yù)在肝臟脂代謝方面無(wú)明顯變化，但是維生素E的氧化應(yīng)激效果顯著，同時(shí)聯(lián)合用藥具有一定優(yōu)勢(shì)。由于這一實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間短，其長(zhǎng)期影響、藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系以及藥物劑量配比等方面仍需更深層次的觀察和研究。