程方貝貝,甘婷婷,趙南京,殷高方,汪 穎,范夢(mèng)西,石朝毅

（1.合肥學(xué)院生物食品與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所 中國科學(xué)院環(huán)境光學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026；4.安徽大學(xué)物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230601）

0 引言

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重。重金屬作為制造、采礦、冶金、化工等工業(yè)活動(dòng)及大量化肥、農(nóng)藥施用等農(nóng)業(yè)活動(dòng)的主要環(huán)境污染物，使得我國水體重金屬污染問題十分突出，江河湖庫底質(zhì)的污染率高達(dá)80.1%[1]。重金屬因具有不可降解性和生物富集性以及致癌、致畸和致突變性，一旦在生物體內(nèi)累積，將嚴(yán)重威脅著人體健康及生態(tài)環(huán)境，并給國民經(jīng)濟(jì)造成重大損失，因此水體重金屬污染問題需高度重視。

現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)水體重金屬可為水體重金屬污染狀況的及時(shí)判斷提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)及重要依據(jù)，對(duì)水體重金屬有效防治及水質(zhì)安全保障具有重要意義。而在重金屬污染現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)方面，X 射線熒光（XRF）光譜法因具有對(duì)待測(cè)樣品無破壞性、多種元素可同時(shí)測(cè)量、譜線干擾少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，是現(xiàn)場(chǎng)快速、實(shí)時(shí)在線分析重金屬元素的一種有效技術(shù)手段。但該方法用于直接測(cè)量水體重金屬時(shí)，水體對(duì)X 射線產(chǎn)生較高的散射背景，從而導(dǎo)致信噪比較低，重金屬檢測(cè)的穩(wěn)定性[4]和靈敏度較差[5]，難以滿足實(shí)際水體重金屬的檢測(cè)要求。因此XRF 光譜法在直接檢測(cè)水體重金屬應(yīng)用方面一直受到限制。

針對(duì)上述問題，目前國內(nèi)外很多研究學(xué)者以活性炭、碳納米管、石墨烯、樹脂等作為吸附劑，采用沉淀/共沉淀[6-7]或固相萃取[8-12]等方法對(duì)水體中的重金屬進(jìn)行分離與富集，再進(jìn)行XRF 光譜測(cè)量與分析，以解決直接測(cè)量水體重金屬XRF 光譜中穩(wěn)定性差、靈敏度低的問題。但以上吸附劑在使用前通常需功能化改性或活化處理，操作過程較為復(fù)雜、繁瑣且費(fèi)時(shí)，并且重復(fù)性較差，增加了水體重金屬監(jiān)測(cè)的難度與應(yīng)用成本。而藻類作為一種生物吸附劑，具有種類繁多、容易獲取、易于培養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等特點(diǎn)。研究表明：藻細(xì)胞對(duì)重金屬具有一定的吸附功能[13-18]，以藻細(xì)胞作為吸附劑富集水體重金屬[19]，不但能夠處理及修復(fù)已受重金屬污染的水體，而且也為XRF 光譜法檢測(cè)水體重金屬提供了新的富集手段。

因此以水體中典型重金屬污染物鉛（Pb）為研究對(duì)象，選擇淡水中較為常見且細(xì)胞分散性較好的蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻4 種淡水微藻為吸附劑，研究分析不同培養(yǎng)時(shí)間及不同藻細(xì)胞狀態(tài)下4 種淡水微藻對(duì)重金屬Pb2+的吸附特性，以篩選出對(duì)重金屬Pb2+具有高效富集能力的合適藻種，為后續(xù)建立基于藻富集的水體重金屬污染快速XRF 監(jiān)測(cè)方法提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種與試劑

主要藻種：蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻（中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫）。在SW-CJ-1D 型無菌工作臺(tái)中將上述藻種接種于滅菌處理后的BG11 培養(yǎng)基中，并將接種后的藻液置于MQD-S3R 型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度為25±1 ℃，光源發(fā)光強(qiáng)度為6 600 lux，光暗比為12 h∶12 h。在培養(yǎng)至第3 天、第7 天和第12 天時(shí)提取純?cè)寮?xì)胞開展對(duì)重金屬Pb2+的吸附實(shí)驗(yàn)。

Pb 的來源：分析純硝酸鉛（Pb(NO3)2）（天津市津北精細(xì)化工有限公司）。用AL104 型電子分析天平準(zhǔn)確稱取一定量的Pb(NO3)2，并用去離子水配制成100 mL 質(zhì)量濃度為100 mg/L 的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用去離子水稀釋Pb2+儲(chǔ)備液，分別配制成不同濃度的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

（1）為排除培養(yǎng)基對(duì)藻細(xì)胞吸附重金屬Pb2+的干擾，采用稱重與抽濾相結(jié)合的方法提取藻培養(yǎng)液中的活藻細(xì)胞，并配制等濃度的純?cè)逡河糜谄鋵?duì)重金屬Pb2+的吸附研究。首先用電子天平稱量質(zhì)量為G1 的空白濾膜（混合纖維素脂膜，孔徑為0.22 m，直徑為50 mm，上海新亞凈化材料廠）作為富集濾膜，對(duì)體積為V 的藻培養(yǎng)液進(jìn)行抽濾，將富集有藻細(xì)胞的濾膜質(zhì)量G2 進(jìn)行再次稱量，根據(jù)富集前、后濾膜的質(zhì)量差與所抽濾的藻培養(yǎng)液的體積比，計(jì)算原藻培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞濃度C，計(jì)算公式（1）如下：

為保證不同藻種及同種藻種在重金屬Pb2+吸附過程中，在不同培養(yǎng)時(shí)間下藻細(xì)胞的用量相同，根據(jù)以上確定的原藻培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞濃度C，通過計(jì)算取一定體積的原藻培養(yǎng)液進(jìn)行抽濾，使富集在濾膜上的藻細(xì)胞質(zhì)量為10 mg，再將濾膜上的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至100 mL 去離子水中，配制成活藻細(xì)胞質(zhì)量濃度為100 mg/L 的純?cè)鍛腋∫骸?/p>

（2）為探究滅活藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+的吸附特性，取適量的原藻培養(yǎng)液置于高壓滅菌鍋中在121 ℃下加熱20 min，待冷卻至室溫后，采用上述同樣方法確定并配制原藻培養(yǎng)液中藻細(xì)胞質(zhì)量濃度為100 mg/L 的滅活純?cè)鍛腋∫骸?/p>

1.3 藻細(xì)胞吸附重金屬Pb2+試驗(yàn)

分別取培養(yǎng)至第3 天、第7 天及第12 天的蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻的純?cè)逡焊?0 mL 置于不同的潔凈錐形瓶中，再分別加入1 mL 不同濃度Pb2+標(biāo)準(zhǔn)工作液，將反應(yīng)液搖勻后置于轉(zhuǎn)速為100 r/min、溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行吸附反應(yīng)，并在反應(yīng)時(shí)間分別為5,10,20,30,40,50 和60 min 時(shí)各取2 mL 反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中。將20 mL 去離子水與1 mL 不同濃度Pb2+標(biāo)準(zhǔn)工作液混合、搖勻，獲得藻細(xì)胞對(duì)不同濃度重金屬Pb2+吸附的空白對(duì)照樣。

1.4 吸附效率計(jì)算

采用iCAP RQ 型電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）測(cè)量吸附后濾液中剩余的Pb2+濃度及未經(jīng)藻細(xì)胞吸附的空白樣品中Pb2+濃度。并根據(jù)公式（2）計(jì)算反應(yīng)時(shí)間為t 時(shí)藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率：

式中：t 為反應(yīng)時(shí)間，min；C0為反應(yīng)液中未經(jīng)藻細(xì)胞吸附的初始Pb2+質(zhì)量濃度（即空白樣品中Pb2+質(zhì)量濃度），mg/L；Ct為在反應(yīng)時(shí)間t 時(shí)經(jīng)過藻細(xì)胞吸附后濾液中剩余的Pb2+質(zhì)量濃度，mg/L；P 為藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)4 種淡水微藻吸附重金屬Pb2+的特性影響

藻細(xì)胞狀態(tài)及活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化，為探究不同培養(yǎng)時(shí)間的藻細(xì)胞是否對(duì)重金屬Pb2+的吸附特性產(chǎn)生影響，對(duì)培養(yǎng)至第3 天、第7 天和第12 天時(shí)蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻的活藻細(xì)胞在60 min 內(nèi)對(duì)質(zhì)量濃度為5 mg/L 重金屬Pb2+的吸附特性進(jìn)行研究，結(jié)果見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下4 種淡水微藻對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率

由圖1可以看出，在相同反應(yīng)時(shí)間下，培養(yǎng)至第3 天的蛋白核小球藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率最高，其次是第12 天，而培養(yǎng)至第7 天的藻細(xì)胞吸附效率最低；培養(yǎng)至第3 天和第7 天的二形柵藻和平裂藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率最高，且兩者沒有明顯差異性，而培養(yǎng)至第12 天的藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率卻有較大程度的降低；培養(yǎng)至第3 天和第12 天的藻銅綠微囊細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率最高，且兩者較為接近，而培養(yǎng)至第7 天的藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率則稍有降低。研究表明：培養(yǎng)時(shí)間不同，不同藻種對(duì)Pb2+的吸附特性具有一定的差異性，但4 種微藻均在培養(yǎng)至第3 天時(shí)表現(xiàn)出對(duì)Pb2+最好的吸附特性，其中蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻在60 min 內(nèi)的吸附效率均已達(dá)到95%以上。推斷其原因是由于培養(yǎng)至第3 天時(shí)，藻細(xì)胞正處于快速生長繁殖階段，旺盛的藻細(xì)胞分裂導(dǎo)致該階段藻細(xì)胞尺寸比較小，細(xì)胞比表面積較大，從而導(dǎo)致相同質(zhì)量的藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率更高。

同時(shí)，由圖1可以看出，不同培養(yǎng)時(shí)間的蛋白核小球藻、二形柵藻、平裂藻對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率均在5 min 時(shí)達(dá)到最大值，在5～60 min 之間蛋白核小球藻和二形柵藻對(duì)Pb2+的吸附效率近乎保持穩(wěn)定，而平裂藻對(duì)Pb2+的吸附效率隨時(shí)間的增加呈緩慢降低再緩慢上升的趨勢(shì)，變化程度不大；不同培養(yǎng)時(shí)間的銅綠微囊藻對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率均在10 min 時(shí)達(dá)到最大值，在10～60 min 之間吸附效率保持不變。由此可見，選用的4 種淡水微藻對(duì)重金屬Pb2+都具有快速吸附特性，在5～10 min 內(nèi)即可達(dá)到最好的吸附效果。姜愛莉等[20]的研究表明，微藻對(duì)重金屬的吸附過程分為2 個(gè)階段，第一階段為被動(dòng)吸附，吸附速度非?？欤叫史浅８?，該階段重金屬僅被吸附到藻細(xì)胞的表面；第二階段為主動(dòng)吸附，是一個(gè)能量驅(qū)動(dòng)過程，藻細(xì)胞對(duì)重金屬的吸附與藻體的代謝密切相關(guān)，需要某些特定酶的參與，因此該階段吸附速度較慢。試驗(yàn)中蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻在5～10 min 內(nèi)即對(duì)重金屬Pb2+達(dá)到最好的吸附效果，該吸附為被動(dòng)吸附過程。

2.2 不同細(xì)胞狀態(tài)的4 種淡水微藻對(duì)吸附重金屬Pb2+的特性影響

在藻對(duì)重金屬吸附研究方面，李愷等[21]發(fā)現(xiàn)，與非活性海藻相比，活性海藻對(duì)重金屬具有更好的吸附特性；而SYAFIUDDIN A 等[22]的研究表明與活藻細(xì)胞相比，非活藻細(xì)胞對(duì)重金屬的吸附效果更好。為驗(yàn)證選用的4 種淡水微藻在何種藻細(xì)胞狀態(tài)下對(duì)重金屬Pb2+具有更好的吸附性能，對(duì)培養(yǎng)至第3 天時(shí)活藻細(xì)胞及加熱滅活藻細(xì)胞2 種細(xì)胞狀態(tài)下4 種微藻吸附重金屬Pb2+的特性進(jìn)行研究。4 種淡水微藻的活藻細(xì)胞及滅活藻細(xì)胞在60 min 反應(yīng)時(shí)間內(nèi)對(duì)質(zhì)量濃度為5 mg/L 的重金屬Pb2+的吸附效率見圖2。

圖2 不同細(xì)胞狀態(tài)下4 種淡水微藻對(duì)重金屬Pb2+的吸附效率

由圖2可以看出，在相同反應(yīng)時(shí)間下，蛋白核小球藻、二形柵藻和銅綠微囊藻均是活藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+具有最大的吸附效率，而滅活后藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率卻有較大程度的降低，例如在反應(yīng)時(shí)間為5 min 時(shí)，蛋白核小球藻活藻細(xì)胞、二形柵藻活藻細(xì)胞和銅綠微囊藻活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率分別為95%,99%和96%，而滅活后吸附效率分別降至55%,68%和65%。并且這3 種藻的活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率均在5～10 min 時(shí)快速吸附達(dá)到最大值，在10～60 min 內(nèi)吸附效率基本保持穩(wěn)定；而滅活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率在5～60 min 內(nèi)卻有較大的變化，穩(wěn)定性較差。因此蛋白核小球藻、二形柵藻和銅綠微囊藻活藻細(xì)胞比滅活藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+具有更好的吸附性能。

在吸附反應(yīng)時(shí)間為5 min 時(shí)，平裂藻活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率要稍大于滅活藻細(xì)胞，在反應(yīng)時(shí)間為10～50 min 時(shí)，滅活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率反而大于活藻細(xì)胞，而在反應(yīng)時(shí)間為60 min 時(shí)，活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效率又大于滅活藻細(xì)胞。并且無論是活藻細(xì)胞還是滅活藻細(xì)胞，在5～60 min 的反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，其對(duì)Pb2+的吸附效率均隨反應(yīng)時(shí)間的增加而變化，活藻細(xì)胞在5 min 時(shí)吸附效率達(dá)到最大值，隨反應(yīng)時(shí)間的延長，吸附效率呈先逐漸降低再緩慢升高的趨勢(shì)；而對(duì)于滅活藻細(xì)胞，在10 min時(shí)吸附效率達(dá)到最大值，之后10～30 min 時(shí)吸附效率保持穩(wěn)定，而在30～60 min 時(shí)，吸附效率隨時(shí)間的增加而呈逐漸降低趨勢(shì)。由此可見平裂藻2 種藻細(xì)胞狀態(tài)對(duì)Pb2+的吸附性能與蛋白核小球藻、二形柵藻和銅綠微囊藻明顯不同。在60 min 反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，平裂藻的滅活藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附效果要略優(yōu)于活藻細(xì)胞，但無論是活藻細(xì)胞還是滅活藻細(xì)胞，其對(duì)Pb2+的吸附效果均不夠穩(wěn)定。

2.3 4 種淡水微藻吸附重金屬Pb2+的性能對(duì)比

為篩選出具有較好吸附重金屬Pb2+性能的淡水藻種，對(duì)培養(yǎng)至第3 天的蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻活藻細(xì)胞吸附不同濃度重金屬Pb2+的特性分別進(jìn)行研究。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5 min 時(shí)，相同濃度的4 種微藻對(duì)質(zhì)量濃度分別為1，1.75，2.5和5 mg/L 重金屬Pb2+的吸附效率見圖3。由圖3可以看出，當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度為5 mg/L 時(shí)，4 種微藻對(duì)Pb2+的吸附效率依次為：二形柵藻＞銅綠微囊藻＞蛋白核小球藻＞平裂藻；當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時(shí)，4 種微藻對(duì)Pb2+的吸附效率依次為：二形柵藻＞蛋白核小球藻＞銅綠微囊藻＞平裂藻；當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度為1.75 mg/L 時(shí)，4 種微藻對(duì)Pb2+的吸附效率依次為：二形柵藻＞蛋白核小球藻＞平裂藻＞銅綠微囊藻；而當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度為1 mg/L 時(shí)，4 種微藻對(duì)Pb2+的吸附效率依次為：蛋白核小球藻＞二形柵藻＞銅綠微囊藻＞平裂藻。由此可見，當(dāng)藻細(xì)胞濃度相同，而重金屬Pb2+濃度不同時(shí)，4 種淡水微藻對(duì)Pb2+的吸附性能排序會(huì)有所變化，綜合來看，二形柵藻及蛋白核小球藻2 種淡水綠藻表現(xiàn)出了更好的吸附特性，其中二形柵藻對(duì)較高濃度的Pb2+有較好的吸附性能，而蛋白核小球藻對(duì)較低濃度的Pb2+表現(xiàn)出更好的吸附性能。因此淡水綠藻中的二形柵藻和蛋白核小球藻更適合于水體中重金屬Pb2+的吸附與富集。此外，當(dāng)藻細(xì)胞用量相同，而重金屬Pb2+濃度不同時(shí)，同種藻細(xì)胞也表現(xiàn)出了不同的吸附特性。由此推斷藻細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附性能可能與反應(yīng)液中藻細(xì)胞與Pb2+濃度或兩者的濃度比值有關(guān)。

圖3 4 種淡水微藻對(duì)不同濃度重金屬Pb2+的吸附效率

3 結(jié)論

（1）試驗(yàn)所選用的蛋白核小球藻、二形柵藻、銅綠微囊藻、平裂藻4 種淡水微藻均具有快速吸附重金屬Pb2+特性，在5～10 min 時(shí)吸附效率即可達(dá)最大值。但培養(yǎng)時(shí)間不同，4 種淡水微藻吸附重金屬Pb2+的特性雖有一定差異性，但均表現(xiàn)在培養(yǎng)至第3天時(shí)對(duì)Pb2+的吸附效率最高。

（2）蛋白核小球藻、二形柵藻和銅綠微囊藻對(duì)重金屬Pb2+的吸附性能均表現(xiàn)為活藻細(xì)胞高于滅活藻細(xì)胞；而平裂藻滅活藻細(xì)胞對(duì)重金屬Pb2+的吸附效果要略高于活藻細(xì)胞。

（3）4 種淡水微藻中二形柵藻及蛋白核小球藻吸附重金屬Pb2+性能更好，其中二形柵藻對(duì)較高濃度的Pb2+有較好的吸附性能，而蛋白核小球藻對(duì)較低濃度Pb2+的吸附性能則更好，因此二形柵藻和蛋白核小球藻更適合于水體中重金屬Pb2+的吸附與富集。該結(jié)論為建立基于藻富集的水體重金屬污染快速監(jiān)測(cè)方法提供了重要依據(jù)。