盛佳鈺，李春陽，江科，薛曉紅

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院乳腺病科，上海 200437)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，50%～60%乳腺癌患者屬于激素依賴型[1]，該類型乳腺癌患者保留全部或部分激素受體及其功能，其發(fā)生和發(fā)展受內分泌的影響及調控。針對激素受體陽性的乳腺癌患者，內分泌治療是常見的治療方式。作為一線內分泌治療藥物——選擇性雌激素受體調節(jié)藥(selective estrogen receptor modulators，SERMs)，他莫昔芬(tamoxifen)、枸櫞酸托瑞米芬(toremifene)在抑制雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性的乳腺癌細胞生長的同時，卻刺激ER陽性的子宮內膜細胞增生，子宮內膜腺體表現囊性擴張樣水腫或形成息肉，間質膠原豐富，而腺上皮細胞萎縮或化生，使子宮內膜呈現出了息肉-增生-惡性變等多樣的變化[2]。對于內分泌治療藥物引起的子宮內膜病變，臨床常采用診斷性刮宮治療，目前尚缺乏有效而無創(chuàng)的治療方法，往往導致患者治療依從性差。在臨床實踐中，筆者發(fā)現同期應用內分泌藥物治療的乳腺癌患者，其子宮內膜病變表現參差不齊。

雌激素主要通過與α受體結合發(fā)揮作用，雌激素受體α(ERα)的基因多態(tài)性可以改變雌激素受體的表達水平及功能，從而影響雌激素的生物學效應。眾多研究均表明[3-5]，ERα基因(主要是第一內含子上兩個限制性片段rs9340799、rs2234693)多態(tài)性與發(fā)生子宮內膜病變的風險顯著相關。因此，本研究將探索 rs9340799、rs2234693位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)與他莫昔芬引起的子宮內膜病變的相關性，試圖從中篩選出容易發(fā)生藥物性子宮內膜病變的基因類型，以盡早預防乳腺癌內分泌治療藥物引起的子宮內膜病變的發(fā)生并為絕經前乳腺癌患病群體的精準治療提供依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料 所有病例來自上海中藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院乳腺病科2018年3—9月期間門診及住院的乳腺癌患者，共164例。納入標準：①長期居住在長三角地區(qū)組患者之間無親緣關系；②符合乳腺癌診斷標準，并經病理細胞學診斷證實；③進行他莫昔芬或托瑞米芬藥物治療>1年的患者；④完成知情同意及相關告知。排除標準：①無明確乳腺癌病理診斷者；②子宮、卵巢切除者或使用促黃體生成素釋放激素類似物者；③合并子宮內膜基礎疾病者及心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病者；④曾經發(fā)生過子宮內膜不良事件者；⑤未完成知情同意及相關告知。164例患者平均年齡(46.85±5.90)歲；接受內分泌治療1～2年、>2～3年、>3～4年、>4～5年及>5年分別有68，46，23，18，9例；其中病理診斷為浸潤性癌的139例，原位癌25例；使用他莫昔芬78例，枸櫞酸托瑞米芬86例。各基因型組臨床資料基線均衡，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2ERα基因SNPs 位點檢測 所有入組對象均抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，置于無菌無酶的乙二胺四乙酸抗凝試管，存放于-20 ℃環(huán)境。引物均由生工生物工程(上海)有限公司設計并合成，如下：rs9340799-FO 5′-GCAGGCTGGGCTCAAACTA-3′，rs9340799-RO 5′-CTTTCATTACCTCTTGCCGTCT-3′，rs2234693-F 5′-ATCCAGGGTTATGTGGCAAT-3′，rs2234693-R 5′-CTAATAGACTTAATGTTTTTGCAGG-3′。

對目標片段進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，PCR反應體系為25 μL，其中基因組DNA模板1 μL，巢式引物Fi 0.5 μL，巢式引物Ri 0.5 μL，dNTP混合物(10 mmol·L-1)0.5 μL，Taq反應緩沖液2.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，水20 μL。PCR反應體系首先在95 ℃預變性3 min，然后進行35個循環(huán)擴增(每個循環(huán)包括 94 ℃變性30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃ 延伸30～60 s)，循環(huán)完畢后進行72 ℃ 修復延伸 10 min。

PCR產物送于生工(上海)生物工程有限公司進行單向測定，測序儀型號為 3730XL (美國 ABI)，結果使用Chromas 軟件分析，見圖 1。

圖1 ERα基因位點測序圖 Fig.1 Sequencing map of ERα gene site

1.3子宮內膜病變觀察 B超檢查觀察子宮內膜厚度，統(tǒng)計行陰道診刮患者例數，計算子宮內膜診刮率。

1.4統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 21.0版 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用PLINK -doc -1.04 對患者測序結果進行 Hardy -Weinberg 遺傳基因分布平衡檢驗。各基因亞型組間的計量和計數資料差異比較采用方差分析和卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1ERα基因rs9340799、rs2234693位點基因型和等位基因分布 164例患者中，ERα基因rs9340799位點，A、G等位基因的分布頻率分別為79%和21%；其中A/A型實際頻數106例，A/G型48例，G/G型10例(P>0.05)。ERα基因rs2234693位點中C、T等位基因的分布頻率為42% 和 58%； 其中C/C型實際頻數為32例、C/T型為74例、T/T型為58例(P>0.05)，說明樣本具有群體代表性。

2.2ERα基因SNPs與子宮內膜厚度及內膜診刮比例的關系 比較 ERα基因rs9340799位點各基因型患者間子宮內膜厚度的差異，發(fā)現該位點的3種基因型(A/A、A/G、G/G)組間子宮內膜厚度值差異有統(tǒng)計學意義(F=3.382 0，P<0.05)；在G顯性模式下，即A/G、G/G基因型患者子宮內膜厚度[(9.63±3.53) mm、(9.00±0.89) mm]均高于A/A基因型患者[(7.73±3.04) mm]。而A/G基因型比A/A基因型患者子宮內膜更厚(F=3.614 0，P<0.05)。比較 ERα基因rs2234693位點各基因型患者間子宮內膜厚度的差異，發(fā)現該位點的3種基因型(C/C、C/T、T/T)組間子宮內膜厚度值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 ERα基因SNPs與子宮內膜厚度的關系 Tab.1 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial thickness

比較 ERα基因rs9340799位點各基因型患者間子宮內膜診刮比例的差異，發(fā)現該位點的3種基因型(A/A、A/G、G/G)組間子宮內膜診刮比例差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.750 0，P<0.05)。其中，A/G基因型患者子宮內膜診刮比例(45.83%)高于A/A及G/G基因型患者(15.09%，0.00%)(χ2=16.800 0，7.384 0，P<0.01)。 較ERα基因rs2234693位點各基因型患者間子宮內膜診刮比例的差異，發(fā)現該位點的3種基因型(C/C、C/T、T/T)組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 ERα基因 SNPs 與子宮內膜診刮比例的關系 Tab.2 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial diagnostic curettage rate

2.3ERα基因SNPs 與不同內分泌藥物治療患者子宮內膜厚度及內膜診刮比例的關系 根據患者服用藥物不同，將患者分為他莫昔芬組和枸櫞酸托瑞米芬組，比較 ERα基因rs9340799位點及rs2234693位點各基因型患者間子宮內膜厚度及診刮比例的差異是否與服用的內分泌藥物種類有關。發(fā)現同一基因型患者，不同藥物組間無論是子宮內膜厚度還是診刮次數均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

但是，在接受枸櫞酸托瑞米芬治療的患者中，子宮內膜厚度與 rs9340799位點SNPs存在相關性，A/G基因患者的子宮內膜厚度較純合基因型A/A、G/G型厚(F=1.553 0，P<0.05)，見表3。且無論是他莫昔芬還是枸櫞酸托瑞米芬組，rs9340799 位點SNP與內膜診刮率均呈顯著相關性(χ2=13.690 0，16.850 0，P<0.01)，見表4。

表3 ERα基因 SNPs 與不同內分泌藥物子宮內膜厚度的關系 Tab.3 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial thickness in patients treated with different endocrine drugs

表4 ERα基因 SNPs 與不同內分泌藥物治療患者子宮內膜診刮率的關系 Tab.4 Relationship between SNPs of ERα gene and endometrial scraping rate in patients treated with different endocrine drugs

2.4ERα基因SNPs與首次子宮內膜診刮時間的關系 根據接受內分泌藥物治療發(fā)生首次子宮內膜診刮時間將受試者分為1年以下、1年及以上兩組，分別分析首次發(fā)生子宮內膜診刮的時間與ERα基因SNPs的關系。發(fā)現首次子宮內膜診刮時間與rs9340799位點SNPs存在顯著相關性(χ2=27.160 0，P<0.01)。同一基因型患者間比較，A/G基因型患者1年內出現內膜診刮事件數明顯多于1年以上者(χ2=4.724 0，P<0.05)，見表5。

表5 ERα基因SNPs與首次子宮內膜診刮時間的關系 Tab.5 Relationship between SNPs of ERα gene and the time of first endometrial scraping

3 討論

他莫昔芬及枸櫞酸托瑞米芬在抑制ER陽性乳腺癌細胞生長的同時，也刺激ER陽性子宮內膜細胞增生。有研究報道[6]，乳腺癌患者手術后口服他莫昔芬引起子宮內膜息肉及子宮內膜增生的發(fā)病率分別為5%～35%及4.7%～16%，而子宮內膜癌的發(fā)病率為0.8%～5%。由此可見，SERMs對不同靶器官具有不同的作用，在乳腺腫瘤組織中發(fā)揮抗雌激素作用，而對子宮內膜則表現為弱雌激素樣作用，能引起一系列子宮內膜病變。對于此類乳腺癌內分泌治療引起的藥物性子宮內膜病變，孕激素治療的安全性仍存疑慮，因此，臨床上絕大多數的患者和醫(yī)生都會選擇通過暫時停止內分泌治療及刮宮來明確診斷并降低子宮內膜厚度[7]。在近10年的內分泌藥物治療過程中，許多乳腺癌患者常常需經歷數次的刮宮治療，有創(chuàng)性操作嚴重影響患者內分泌治療的依從性。

然而并不是每一例服用SERMs藥物的乳腺癌患者均會發(fā)生子宮內膜病變，即使發(fā)生內膜病變，在內分泌藥物使用時間相同的情況下，患者內膜增厚及病變的程度也差異巨大。早期將這種情況的解釋歸于個體對于內分泌調節(jié)功能的差異，近年來，遺傳因素受到人們的重視和認可。雌激素主要通過與α受體結合發(fā)揮作用，ERα的基因多態(tài)性可以改變雌激素受體的表達水平及功能，從而影響雌激素的生物學效應。本研究探索他莫昔芬或枸櫞酸托瑞米芬內分泌治療(>1年)的乳腺癌患者ERα基因 rs9340799、rs2234693位點 SNPs 與藥物引起的子宮內膜病變的相關性，研究結果發(fā)現，ERα基因rs9340799位點3個亞型(A/A、A/G、G/G)患者的子宮內膜厚度值及陰道診刮比例比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，A/G基因型患者子宮內膜平均厚度和陰道診刮比例均高于A/A及G/G基因型患者(P<0.05)。而ERα基因rs2234693位點的3個基因亞型(T/T、C/T、C/C)患者的子宮內膜厚度及陰道診刮比例均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。進一步本研究還發(fā)現，他莫昔芬和枸櫞酸托瑞米芬兩種不同的SERMs藥物所引起的子宮內膜增厚及陰道診刮比例并無明顯差異。但是，在接受枸櫞酸托瑞米芬治療的受試者中，子宮內膜厚度與 rs9340799位點SNPs存在相關性(P<0.05)。且無論是他莫昔芬組還是枸櫞酸托瑞米芬組，rs9340799 位點SNPs與內膜診刮數均呈顯著相關性(P<0.01)?？梢?，ERα基因rs9340799位點A/G亞型患者時子宮內膜病變的高發(fā)人群。此外，還發(fā)現首次子宮內膜診刮時間與rs9340799位點SNPs存在顯著相關性(P<0.01)。同一基因型患者間比較，A/G基因型患者1年內出現內膜診刮事件數明顯多于1年以上者(P<0.05)。由此可見，他莫昔芬和枸櫞酸托瑞米芬引起的子宮內膜病變基本相同，因此，臨床上當患者出現子宮內膜增厚的情況時，進行兩種藥物間的更換意義不大。而攜帶有子宮內膜病變易感型基因——A/G基因的患者，其子宮內膜事件發(fā)生時間較早(多在1年內)，臨床可以針對該部分患者進行中醫(yī)藥的預防干預，或者提前予以卵巢去勢。

既往研究主要集中于自然內分泌失調導致雌激素水平異常的女性人群[3，8]，鮮少涉及藥物引起雌激素水平改變所致的子宮內膜病變與ERα基因多態(tài)性的關系，它與自然雌激素水平改變所導致的子宮內膜病變是否存在差異也無從考證。本研究發(fā)現，ERα基因rs9340799位點A/G亞型患者是SERMs藥物引起子宮內膜病變的高發(fā)人群。但與GEORGOPOULOS等[9]的研究結果不一致。進一步查閱文獻發(fā)現，針對不同人群開展的研究，其結果也存在諸多不一致[3]。分析原因，主要考慮由于人種及地區(qū)的差異導致的雌激素受體基因表達呈現明顯的差異。所以本研究將目標人群限定為長期生活在長三角地區(qū)的無親緣關系的乳腺癌患者，從一定程度上規(guī)避了因人種、地區(qū)差異引起的基因改變。但在整個研究過程中，有32例患者月經不定期，甚至長期不來潮，行婦科B超檢查的時間較難把握，可能造成子宮內膜厚度檢測的偏差。由于本次研究所收集的病例數較少，不適合進行分層分析，下一步研究中，將擴大樣本量，按月經情況進行分層分析，將進一步消除由于婦科B超檢測時間造成的誤差。