徐博，吳畏難，沈楠，安英

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 132013；2.吉林市中心醫(yī)院普通外科，吉林 132011)

鐵皮石斛在民間素有“救命仙草”之稱，具有抗肝損傷、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗氧化、促消化、抗腫瘤等功效[1]。由于滋陰潛陽(yáng)作用和廣泛的保健功效，鐵皮石斛一直被視為石斛中的珍品[2-3]。本課題組前期研究表明，鐵皮石斛普通粉(dendrobium officinale powders，DOP)在改善肝功能和護(hù)肝方面具有一定的療效。但因其價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用始終受限。近年來(lái)研究的納米中藥有許多新的特點(diǎn)和功能，可以降低患者用藥量，節(jié)約有限的中藥資源，降低不良反應(yīng)，提高生物利用度、靶向性，呈現(xiàn)新藥效，拓寬原藥適應(yīng)證[4]。筆者采用納米技術(shù)改變粒徑大小，精制成鐵皮石斛無(wú)菌納米粉(dendrobium officinale nanoparticles，DON)，豐富了中藥的劑型選擇，目前文獻(xiàn)中對(duì)其保護(hù)肝損傷在藥效和機(jī)制方面的研究報(bào)道較少，因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠肝損傷模型，觀察DON對(duì)相關(guān)生化指標(biāo)、炎癥因子表達(dá)、肝臟病理及肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變等方面的影響，探討其作用機(jī)制[2，5]，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 鐵皮石斛(浙江鐵楓堂藥業(yè)有限公司)，DON[采用超臨界反溶劑法聯(lián)合高壓蒸汽滅菌法制備，經(jīng)納米粒度儀測(cè)定平均粒徑為(100±30)nm]，DOP(粒徑0.425 mm)，均由北華大學(xué)藥學(xué)院根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需粒徑要求制備并鑒定。護(hù)肝片(吉林省松遼制藥公司)；四氯化碳(CCl4，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；IL-1β抗體(武漢愛博泰克生物科技公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 SALD-7500nano納米粒度儀(日本島津公司)，PM100行星式球磨儀(德國(guó)Retsch公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)，HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠)，BX53正置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Tecnai G2 Spirit透射電子顯微鏡(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠40只，雌雄兼用，體質(zhì)量(20±2) g，購(gòu)至吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)：2009-0005。室溫常規(guī)飼養(yǎng)，相對(duì)濕度75%，每天換水1次，每天光照12 h。

1.4方法

1.4.1分組、造模和給藥方法 小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、DON組和DOP組各10只，正常對(duì)照組灌胃給予純化水，DON組和DOP組按相應(yīng)藥物劑量(0.30 mg·kg-1)給予，每天1次。造模為每周2次(星期一、星期四)，給藥后1 h，除正常對(duì)照組外，各組分別皮下注射20%CCl4花生油溶液(2 mL·kg-1)，正常對(duì)照組給予同等劑量花生油溶液。給藥和造模均為第1周的星期一開始給藥，共8 周。末次造模藥給予12 h后，采集各組小鼠血清和肝組織標(biāo)本，進(jìn)一步行肝功能生化指標(biāo)(每組10只)、肝病理學(xué)檢測(cè)及電鏡觀察(隨機(jī)選取每組3～5只)[6]。

1.4.2檢測(cè)生化指標(biāo) 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)AST、ALT、LDH、CAT、TNF-α及IL-6含量。

1.4.3免疫組化法檢測(cè)肝組織中IL-1β的表達(dá) 取肝組織0.1 g，置10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋并切片，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，免疫組化法處理，具體流程按試劑盒說(shuō)明書操作。晾干后置于顯微鏡下觀察并攝像。用Motic Images Advanced 3.2版軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.4蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)改變 血液標(biāo)本收集完畢，處死大鼠，取整個(gè)肝左葉，置10%甲醛溶液固定，用于制作HE 染色切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

1.4.5小鼠肝臟電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 同上處理，取肝右葉1 mm3，置2.5%戊二醛溶液固定，制作電鏡切片(由上海賽新生物科技有限公司完成)，透射電子顯微鏡觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)改變。

2 結(jié)果

2.1DON對(duì)小鼠血清AST、ALT、LDH、CAT活力的影響 見表1。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組AST、ALT、LDH活力顯著升高(P<0.01)，CAT活力明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，DON和DOP組，血清 ALT、AST 、LDH水平均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，CAT活性增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)； 同等劑量下，與DOP組比較，DON組AST、ALT活力顯著降低(P<0.05)，CAT活力顯著升高(P<0.05)。

表1 4組小鼠血清AST、ALT、LDH、CAT活力比較 Tab.1 Comparison of the serum activity of AST，ALT，LDH and CAT among four groups of mice

2.2DON對(duì)小鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響 見表2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TNF-α和IL-6含量顯著增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，DON組和DOP組TNF-α和IL-6含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)； 與DOP組比較，DON組TNF-α和IL-6含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，DON更明顯減輕肝損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

2.3肝組織中IL-1β的表達(dá) 見圖1。IL-1β在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的目標(biāo)蛋白為棕黃色。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中 IL-1β表達(dá)明顯增加(t=27.10，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，DON組和DOP組IL-1β表達(dá)均明顯降低(t=4.28，P<0.05，t=15.63，P<0.01)；與DOP組比較，DON組IL-1β表達(dá)顯著降低(t=14.33，P<0.01)。

圖1 4組小鼠肝組織中IL-1β的表達(dá) (×200) Fig.1 IL-1β expression in livers in four groups of mice(×200)

2.4DON對(duì)肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響 見圖2。光鏡顯示，正常對(duì)照組小鼠肝組織具有完整的結(jié)構(gòu)，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)變性或壞死，肝小葉和肝竇清晰規(guī)則且整齊排列，肝細(xì)胞呈索放射狀分布于中央靜脈周圍； 模型對(duì)照組肝組織呈現(xiàn)出紊亂的肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞索，肝細(xì)胞腫脹變大呈圓形且大小不勻，與周圍組織界限不清，有程度不同的壞死，肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不一空泡，并有氣球樣及水樣變性，肝竇變形變窄；DON組和DOP組肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)水樣變性及氣球樣變有所改善，炎癥損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較模型對(duì)照組均有不同程度改善，其中DON組最為明顯。

圖2 4組小鼠肝臟組織的病理學(xué)變化(×200) Fig.2 Pathological changes of livers in four groups of mice(×200)

表2 4組小鼠血清TNF-α和IL-6含量比較 Tab.2 Comparison of the serum level of TNF-α and IL-6 among four groups of mice

2.5DON對(duì)肝損傷小鼠超微結(jié)構(gòu)變化的影響 見圖3。正常對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁明顯，肝細(xì)胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴排列規(guī)整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富；模型對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫大甚至破裂或變形，數(shù)量減少，可見彌漫散在分布大小不等脂滴，部分肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失； DON組和DOP組與模型對(duì)照組比較，肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)明顯改善，其中DON組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸接近正常，核周圍脂滴數(shù)量及分布均有改善，仍有損傷性肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但腫脹線粒體少，且腫脹程度較輕，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，部分輕度擴(kuò)張。

圖3 4組小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)變化(×5000) Fig.3 Ultrastructural changes of livers in four groups of mice(×5000)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提前給予DON可顯著抑制CCl4攝入所引起的血清中ALT、AST、LDH的活性升高和CAT活性降低。提示DON對(duì)小鼠受損的肝功能和肝臟組織具有改善與修復(fù)作用，且明顯優(yōu)于DOP。

單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在CCl4作用下向肝臟積聚，致敏的巨噬細(xì)胞會(huì)釋放一些炎癥遞質(zhì) ( 如自由基、IL-1β 和 TNF-α 等)，誘發(fā)炎癥，從而造 成 肝 細(xì) 胞 損 傷。其中，TNF-α 是最關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一[7]。釋放細(xì)胞因子水平較低時(shí)，IL-1β的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)主要有兩方面，其一可引起組織局部炎癥反應(yīng)，其二可進(jìn)一步促進(jìn) IL-6 合成[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DON比DOP更顯著降低TNF-α、IL-1β 水平，可能是其保護(hù)CCl4致慢性肝損傷的重要因素之一。

光鏡下模型對(duì)照組肝組織發(fā)生了明顯的改變，且呈彌漫性，并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死，顯示造模效果良好。用DON干預(yù)后，可見受損的肝細(xì)胞有明顯修復(fù)，細(xì)胞質(zhì)水樣變性及氣球樣變有所改善，且比DOP組顯著[9-10]。

透射電鏡可以觀察肝臟線粒體結(jié)構(gòu)的損傷情況[11]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組可見線粒體出現(xiàn)腫脹，線粒體內(nèi)峭模糊，外膜破損，空泡樣改變，基質(zhì)密度不同程度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少等超微結(jié)構(gòu)變化。DON組和DOP組肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改善，細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，脂滴的聚集顯著減少，細(xì)胞核變圓變大。DON比DOP的抗炎作用更明顯。DON對(duì)慢性肝損傷小鼠無(wú)論肝臟病理組織學(xué)還是肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出了一定的保護(hù)作用，這為鐵皮石斛納米化應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。

納米化后的鐵皮石斛具有更強(qiáng)的清除自由基、抗氧化、抗炎作用，肝靶向性顯著增強(qiáng)，可清除體內(nèi)大量的自由基，從而達(dá)到更好的保護(hù)肝臟細(xì)胞的作用。綜上所述，無(wú)論從肝功能指標(biāo)還是組織學(xué)結(jié)果分析均顯示DON對(duì)肝臟的保護(hù)作用優(yōu)于其未納米化。