張明星 李 潔 張玄妮 李歡歡 謝 娟 徐學鋒

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣州 510642）

雞樅菌（Termitomycesspp.）隸屬于擔子菌門傘菌綱傘菌目離褶傘科蟻巢傘屬，其子實體不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富，還具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗氧化[2]、降血糖[3]等功效，是一種集食用和藥用于一身的珍貴食用菌。雞樅菌作為一個與白蟻共生的菌類，其原生環(huán)境十分復雜，且菌絲生長于白蟻活動的菌圃之上，再加上其與菌圃之間的關系錯綜復雜、與菌圃內(nèi)部的白蟻協(xié)同進化，其生理生化特性尚未明晰，故長期以來，其子實體只能在部分地區(qū)的特定季節(jié)，以野生采摘的形式獲取，種質(zhì)資源利用十分受限。目前，人工栽培雞樅菌的嘗試與研究較多，但效果均一般，且關于雞樅菌生長條件的研究報道較少[4-7]，故至今無法實現(xiàn)真正意義上的雞樅菌人工馴化。而雞樅菌菌絲體采用液體發(fā)酵培養(yǎng)技術，具有發(fā)酵速度快、周期短的特點，這有助于雞樅菌的人工馴化和資源利用。在此背景下，筆者對雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的配方進行了優(yōu)化，以期完善雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)技術。現(xiàn)將相關試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生雞樅菌（Genebank：MW692851，Sequence ID：AB960801.1）于2019年7月采集于華南農(nóng)業(yè)大學。該菌株菌蓋長8～12 cm，中央尖突，顏色為灰褐色或暗褐色，菌蓋邊緣為灰白色，邊緣形狀不規(guī)則，呈輻射狀開裂，有柱狀菌索。采用組織分離法獲得雞樅菌菌絲體，其菌絲細密，易在培養(yǎng)基（PDA）上形成褶皺，屬于匍匐型（菌絲體形態(tài)特征描述參照龍正海等[8]）。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑及培養(yǎng)材料

具體為：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麥芽浸提物、可溶性淀粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)），硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂（購于廣東光華化學廠有限公司），葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鉀[購于福晨(天津)化學試劑有限公司]，麥芽糖、乳糖、蔗糖（購于天津富宇精細化工有限公司），膨化豆粕[購于益海（連云港）糧油工業(yè)有限公司]，小麥麩皮[購于益海嘉里（鄭州）食品工業(yè)有限公司]。

1.2.2 試驗儀器

具體為：HVE-50型全自動高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司），雷磁pHs-25型數(shù)顯pH計（上海偉業(yè)儀器廠），SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），TG-16W臺式高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），F(xiàn)SH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機（常州市國旺儀器制造有限公司），101AS-3電熱鼓風干燥箱（上海浦東躍東欣科學儀器廠），LRH-250A型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠），SPH-2102C立式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海四平試驗設備有限公司）。

1.2.3 供試培養(yǎng)液制備

基礎培養(yǎng)液（PD）：取土豆200.0 g，熬汁過濾后加葡萄糖20.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

改良PD培養(yǎng)液：PD培養(yǎng)液取1 L，加入硫酸鎂1.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g，pH自然。

1.3 試驗設計

1.3.1 雞樅菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)試驗

將平板中的菌種接入50 mL錐形瓶中，加入20 mL無菌水，并用均質(zhì)機在轉速10 000g下工作30 s，將打碎的菌絲液吸入改良PD培養(yǎng)液中，每瓶加入5 mL菌液，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。將活化的一級菌種過濾、沖洗，然后將菌球倒入50 mL錐形瓶中，加入5 mL無菌水，并用均質(zhì)機在轉速10 000g下勻漿30 s，然后將其全部轉移到裝有300 mL無菌水的500 mL錐形瓶中混勻。將活化的菌種液，以5%的接種量接種到改良PD培養(yǎng)液中，共接種54瓶，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔12 h取樣1次，每次取3瓶，用蒸餾水將發(fā)酵好的菌液清洗3次，于80 ℃烘箱中烘至恒重，檢測菌絲體生物量，并確定雞樅菌發(fā)酵的截止時間，以作為后續(xù)單因素試驗的最佳發(fā)酵時間。

1.3.2 單因素試驗

為明確培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH、硫酸鎂添加量、磷酸二氫鉀添加量、硫酸銅添加量、碳源、氮源等因素對雞樅菌菌絲生長的影響，在不同碳源、氮源、pH和不同硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銅添加量的培養(yǎng)液中接入5%的活化菌種液，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到雞樅菌菌絲體最佳發(fā)酵時間，取出已發(fā)酵好的菌液用蒸餾水清洗3次，于80 ℃烘箱中烘至恒重，檢測菌絲體生物量。具體為：（1）培養(yǎng)溫度試驗。向同上述1.3.1步驟中的改良PD培養(yǎng)液中接種一級菌種，并于22、25、28、31、34 ℃下進行黑暗培養(yǎng)。每處理重復3次。（2）培養(yǎng)液pH試驗。用1%NaOH和1%HCl 調(diào)節(jié) PD 培養(yǎng)液的 pH 分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。每處理重復3次。（3）硫酸鎂試驗。向PD培養(yǎng)液中加入硫酸鎂，添加量（質(zhì)量濃度）分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。每處理重復3次。（4）磷酸二氫鉀添加量試驗。向PD培養(yǎng)液中加入磷酸二氫鉀，添加量（質(zhì)量濃度）分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。每處理重復3次。（5）硫酸銅添加量試驗。向PD培養(yǎng)液中加入硫酸銅，添加量（質(zhì)量濃度）分別為 0、0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 g/L（硫酸銅溶液要與培養(yǎng)液分開單獨滅菌）。每處理重復3次。（6）碳源試驗。碳源添加量（質(zhì)量濃度）分別為葡萄糖2.0 g/L、乳糖2.0 g/L、果糖2.0 g/L、淀粉2.0 g/L、蔗糖2.0 g/L、麥芽糖2.0 g/L。每處理重復3次。（7）氮源試驗。以20 g葡萄糖為基礎加入氮源，氮源添加量（質(zhì)量濃度）分別為酵母浸膏3.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、硝酸銨3.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、膨化豆粕5.0 g/L、麥芽浸汁2.0 g/L。每處理重復3次。

1.3.3 最優(yōu)培養(yǎng)液配方組合篩選

本試驗以菌絲體生物量為主要測量指標，并參考常見的食用菌優(yōu)良液體發(fā)酵感官指標，以菌液澄清、無異味，菌球輪廓清晰、大小均一為宜[9-12]，選擇對雞樅菌菌絲體生物量影響較為顯著的三個因素進行組合，每個因素設3個水平，篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)液配方組合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS V20.0進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的生長特性

由圖1可知，在發(fā)酵培養(yǎng)的第3天到第5天，雞樅菌菌絲體生物量急劇增加；從第5天開始，雞樅菌菌絲體生物量增速變緩；第6天到第7天，雞樅菌菌絲體生物量雖有所增加但不顯著；從第8天開始，雞樅菌菌絲體生物量顯著降低。據(jù)觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)開始后的第2天，菌絲體變化不明顯；第3天開始，能明顯觀察到菌絲體向四周伸長；第4天，菌絲體逐漸變圓有毛刺；第5天，能觀察到菌絲體毛刺減少，菌球變飽滿；第6天，菌球飽滿、圓滑；第7天變化不明顯；第8天菌絲體自溶，時間越往后自溶現(xiàn)象越明顯。綜合菌絲體生物量變化和發(fā)酵現(xiàn)象，最終確定發(fā)酵截止時間為第7天。

圖1 雞樅菌菌絲體在液體發(fā)酵培養(yǎng)中生長曲線

2.2 培養(yǎng)溫度對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖2可知，當培養(yǎng)溫度低于28 ℃時，雞樅菌菌絲體生物量隨培養(yǎng)溫度的增加而顯著增加；當培養(yǎng)溫度為28 ℃時，雞樅菌菌絲體生物量達到最大，為11.03 g/L；當培養(yǎng)溫度高于28 ℃時，雞樅菌菌絲體生物量顯著降低，且培養(yǎng)溫度為31 ℃時雞樅菌菌絲體生物量顯著低于培養(yǎng)溫度為22 ℃時的雞樅菌菌絲體生物量，表明高溫對雞樅菌菌絲生長有害。但是，由于低溫、高溫對雞樅菌菌絲體生物量的抑制作用均顯著，且恒溫振蕩培養(yǎng)箱本身存在一定的溫控誤差，故在后續(xù)試驗中將不再調(diào)查培養(yǎng)溫度對雞樅菌菌絲體生物量的影響。經(jīng)綜合考慮，最終確定雞樅菌菌絲體的最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。

圖2 培養(yǎng)溫度對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.3 培養(yǎng)液pH對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖3可知，雞樅菌菌絲體生物量隨培養(yǎng)液pH的增加呈先增加后降低的趨勢，當培養(yǎng)液pH為6.0時，雞樅菌菌絲體生物量達到最高，為10.87 g/L。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長狀態(tài)可知，在不同pH的培養(yǎng)液中，菌液的澄清程度和菌球形態(tài)無明顯變化。經(jīng)綜合考慮，最終確定雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的最適pH為6.0。

圖3 培養(yǎng)液pH對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.4 硫酸鎂不同添加量對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖4可知，雞樅菌菌絲體生物量隨硫酸鎂添加量的增加大體上呈先增加后降低的趨勢，當硫酸鎂添加量為1.0 g/L時，雞樅菌菌絲體生物量為最高，達11.10 g/L。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長狀態(tài)可知，當硫酸鎂添加量高于1.5 g/L時，菌球會發(fā)生自溶，表明硫酸鎂添加量對雞樅菌菌絲體菌球形狀的影響較大。經(jīng)綜合考慮，最終確定硫酸鎂的最適添加量為1.0 g/L。

圖4 硫酸鎂不同添加量對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.5 磷酸二氫鉀不同添加量對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖5可知，雞樅菌菌絲體生物量隨磷酸二氫鉀添加量的增加大體上呈先增加后降低的趨勢，當磷酸二氫鉀添加量為1.0 g/L時，雞樅菌菌絲體生物量達到最高，為10.70 g/L；當磷酸二氫鉀添加量為1.5 g/L時，雞樅菌菌絲體生物量顯著降低。經(jīng)綜合考慮，最終磷酸二氫鉀的最適添加量為1.0 g/L。

圖5 磷酸二氫鉀不同添加量對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.6 硫酸銅不同添加量對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖6可知，雞樅菌菌絲體生物量隨硫酸銅添加量的增加而顯著降低，經(jīng)分析，這可能是因為土豆汁中的銅離子已足夠供應雞樅菌菌絲體生長，或是硫酸銅對雞樅菌菌絲體有毒害作用，額外添加銅離子會抑制雞樅菌菌絲體的生長。

圖6 硫酸銅不同添加量對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.7 不同碳源對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖7可知，不同碳源對雞樅菌菌絲體生物量有顯著影響，以碳源為葡萄糖時，雞樅菌菌絲體生物量顯著高于其他碳源，為11.70 g/L。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長狀態(tài)可知，以淀粉為碳源時，菌液渾濁，菌球形狀不規(guī)則，自溶現(xiàn)象明顯；以果糖為碳源時，菌液澄清、靜置分層，且與其他碳源相比，菌球偏大且密度較低；以葡萄糖為碳源時，菌液澄清、靜置不分層，菌球大小均一懸浮能力強。經(jīng)綜合考慮，最終雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適碳源為葡萄糖。

圖7 不同碳源對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.8 不同氮源對雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖8可知，不同氮源對雞樅菌菌絲體生物量有顯著影響，以膨化豆粕為氮源時，雞樅菌菌絲體生物量顯著高于其他氮源，達11.42 g/L；而以牛肉膏及麥芽浸汁為氮源時，雞樅菌菌絲體生物量均與以膨化豆粕為氮源相差不大，且均顯著高于以酵母浸膏、蛋白胨及硝酸銨為氮源。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長狀態(tài)可知，以蛋白胨為氮源時，菌株大小均一性差；以膨化豆粕為氮源時，菌液澄清，菌球飽滿且相對較硬；以硝酸銨為氮源時，菌液澄清，菌球小而細膩；以牛肉膏、酵母膏和麥芽浸汁為氮源時，菌液澄清，菌球飽滿，菌絲細膩程度介于以膨化豆粕與硝酸銨為氮源之間。經(jīng)綜合考慮，最終取膨化豆粕為雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適氮源。

圖8 不同氮源對雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.9 雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的最優(yōu)配方組合

綜合單因素試驗結果表明，選擇對雞樅菌菌絲體生物量影響較為顯著的氮源、培養(yǎng)液pH和磷酸二氫鉀添加量三個因素進行組合。由表1可知，以2號培養(yǎng)液對雞樅菌菌絲體的生長促進作用最為顯著，菌絲體生物量達11.6 g/L。

表1 雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的最優(yōu)配方組合

3 結 論

試驗結果表明，供試雞樅菌菌絲體在供試培養(yǎng)液上均能生長，但生長速度差異達顯著水平，說明培養(yǎng)溫度、磷酸二氫鉀添加量、培養(yǎng)液pH、碳源、氮源對菌絲體的生長都有一定影響。單因素試驗結果顯示，在本試驗條件下，雞樅菌菌絲體生長的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為膨化豆粕，最適硫酸鎂添加量為1.0 g/L，最適磷酸二氫鉀添加量為1.0 g/L，最適培養(yǎng)液pH為6.0，最適培養(yǎng)溫度為28℃；最優(yōu)培養(yǎng)液配方組合篩選試驗結果顯示，雞樅菌菌絲體生長的液體培養(yǎng)液配方以氮源為膨化豆粕、硫酸鎂添加量為1.5 g/L、培養(yǎng)液pH為6.0最適宜，此配方的雞樅菌菌絲體生物量最高，達11.6 g/L，該配方組合結果與前人的研究結果一致，但雞樅菌菌絲體生物量有一定差距[13]，這可能是因為雞樅菌的種類不同，或是因為與雞樅菌共生的白蟻種屬不同，或是因為雞樅菌經(jīng)離體培養(yǎng)優(yōu)化之后，嗜好生存條件不同[14]，或是因為發(fā)酵后雞樅菌菌絲體的酶種類及酶活性在一定程度上存在差異[15-16]。

在本試驗中，鑒于雞樅菌菌絲體生長緩慢，菌絲茂密程度不一，菌齡相差較大等，本試驗對其接種方式進行了改進，有別于傳統(tǒng)的打孔法接種，本試驗事先在無菌條件下將菌絲打碎，得到了相對均一的菌液。同時，在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)液對雞樅菌菌絲體不同生長階段的影響不一，這說明菌絲生長的全過程是變量生長曲線。此外，在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，菌球形態(tài)易受硫酸鎂添加量和碳源種類的影響，具體表現(xiàn)為菌絲輪廓不清晰，容易自溶，故對這兩類物質(zhì)的添加要額外注意；而培養(yǎng)液氮源為膨化豆粕時，菌絲體生物量相對最大，菌球也比其他氮源的飽滿、硬，且菌液中蘑菇的香味最濃烈，這可能是因為膨化豆粕在為雞樅菌提供氮源的同時，還提供了一定的木質(zhì)纖維素，雞樅菌對其進行降解時分泌出了香味。