文 /王鵬，張寶仁，金蓮華

據(jù)統(tǒng)計顯示，我國大概有90萬例/年新生兒出現(xiàn)生理缺陷，其中比較常見的原因是異常DNA，發(fā)病率可達(dá)0.6%，其中又以21-三體綜合征較為高發(fā)[1]?；虻妮d體是染色體，異常DNA表達(dá)代表身體異常，基因表達(dá)異常，目前臨床對其發(fā)病機(jī)制還未完全明確，研究認(rèn)為跟DNA多種因素共同作用下發(fā)生斷裂與重新連接有關(guān)[2]，在臨床檢查中多以羊水染色體核型分析作為此病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但畢竟是有創(chuàng)傷檢查，孕婦依從性不高，而且操作煩瑣，出結(jié)果用時長，難以把它作為普遍篩查項(xiàng)目[3]。隨著近年來無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)的迅猛發(fā)展，其廣泛檢測應(yīng)用于孕婦胎兒染色體異常。本文旨探討無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)在孕婦不同年齡及申請理由檢測胎兒染色體異常的臨床應(yīng)用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2017年5月至2019年5月在浦東新區(qū)婦幼保健院接受產(chǎn)前診斷中心無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（NIPT-plus)的孕婦3123位，納入指標(biāo):（1）全部研究對象病歷,檢驗(yàn)檢查項(xiàng)目及B超數(shù)據(jù)完整;（2）全部孕婦都沒有任何身體異常表現(xiàn),沒有臨床異常數(shù)據(jù)，NITP檢查全部自愿，并于知情同意書簽字；（3）不納入指標(biāo)：雙胞胎以及以上者孕婦,短期內(nèi)接受過干細(xì)胞治療，免疫治療、及短期內(nèi)手術(shù)或有輸血史。本文在經(jīng)過院倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 方法

（1）①收集標(biāo)本：孕婦取坐姿休息5分鐘后使用血常規(guī)抗凝管采取孕婦4-5ml靜脈血，在離心機(jī)內(nèi)以1500rmin的轉(zhuǎn)率離心15分鐘，移液器采集血漿，對分離血漿進(jìn)行再次離心，去除殘留血細(xì)胞；②收集游離DNA：使用磁珠分離從收集血漿樣本中經(jīng)裂解、分離、純化并提取游離DNA，為確保能夠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，且保證DNA片段多態(tài)性具有代表性。收集過程需要建立SOP文件,保證采集血液的合格性。③制作檢測測序庫：將制備好的DNA片段行尾端恢復(fù)、補(bǔ)全，同時進(jìn)行測序斷基因擴(kuò)增，文庫和分純,必須按所有操作按SOP文件進(jìn)行，擴(kuò)增后DNA濃度要大于0.2ng/mg，且DNA片段在150-200bp之間[4]；④測序與分析：使用3500測序儀(ABI)對DNA片段的基因序列,行電泳,提純分析數(shù)據(jù)。對DNA檢測結(jié)果為高風(fēng)險孕婦進(jìn)行相關(guān)咨詢征得孕婦同意后進(jìn)行介入產(chǎn)前診斷。

（2）羊水染色體核型分析通過超聲定位后穿刺抽取孕婦羊水25ml，離心后取0.5ml沉淀、培養(yǎng)，得到分裂中期細(xì)胞，然后經(jīng)過低滲、固定、吉姆薩染色處理，最后進(jìn)行染色體核型分析。

（3）跟蹤訪問經(jīng)電話或者查詢我院病歷記錄等方式跟蹤外周血DNA檢測陰性產(chǎn)婦后續(xù)情況（包括有無流產(chǎn)、小孩身體情況等）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS28.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表述;計數(shù)資料采用例或百分率表示，計算NITP檢測數(shù)據(jù)的敏感度及差異。

2 結(jié)果

（1）孕期不同NIPT陽性分布孕早期檢出異常比例1.10%(10913)，孕中期異常比例0.95%(151575),孕晚期異常比例0.94%(7635)。詳見表1。

表1 不同孕期NIPT陽性分布

（2）申請理由不同者NIPT異常分布高年齡段檢出異常1.2%(10831)，外周血DNA異常比例0.94%(9957)，B超指標(biāo)異常占1.1.1%(7635)，其他自己申請NIPT檢查異常占0.71%(5700)。詳見表2。

表2 不同申請NIPT理由者NIPT陽性分布

3 討論

新生兒出現(xiàn)生理缺陷主要是由胚胎發(fā)育異常導(dǎo)致。其表現(xiàn)多為智力缺陷或器官形體或功能異常，胚胎異常主要由遺傳因子決定，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。為了解決新生兒出現(xiàn)生理異常，產(chǎn)前檢查顯得尤為重要[5]。遺傳物質(zhì)的載體是染色體，異常染色體是最常見出生缺陷原因[6]。盡管NITP已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前非整數(shù)倍體應(yīng)用當(dāng)中,且檢查為無創(chuàng)的,但對于比較罕見的染色體異常的臨床應(yīng)用價值逐漸被學(xué)者們提出異議,有學(xué)者認(rèn)為染色體疾病并非流行性疾病,流行率較低,缺乏充分證據(jù)證明染色體檢查有必要作為產(chǎn)前篩查指標(biāo)，但血清學(xué)產(chǎn)前篩查是三級防控中的二級防控中重要的環(huán)節(jié)，對于我國出生缺陷防控有著重要意義[7]。但現(xiàn)階段血清學(xué)篩查陽性率有限，就算是四聯(lián)血清學(xué)篩查檢測，陽性檢出率也只有80%左右，且假陽性率較高[8]。NIPT因其無創(chuàng)性廣受孕婦接納。對以往的大面積篩查實(shí)驗(yàn)當(dāng)中表明，使用NITP產(chǎn)前篩查能大量地降低羊水穿刺作為產(chǎn)前診斷金標(biāo)準(zhǔn)帶來的創(chuàng)傷性檢查，也在一定程度上降低了醫(yī)療資源的過度浪費(fèi)和無效使用.診斷的目的在于防止新生兒有嚴(yán)重的染色體疾病，現(xiàn)階段各類實(shí)驗(yàn)證明外周血DNA檢測能夠準(zhǔn)確地檢測出一批染色體疾病的新生兒，然而因?yàn)橘M(fèi)用等問題，深度測序的CNV在用于臨床篩查顯得不切實(shí)際，所以采用低深度的外周血DNA檢測作為臨床篩查更顯得極為重要，在保證了準(zhǔn)確性和無創(chuàng)性的同時又保持了成本的可控，同時還實(shí)現(xiàn)了NITP的高效性。隨著我們對數(shù)據(jù)庫的不斷完善社會對外周血DNA檢測會逐漸認(rèn)可，逐漸發(fā)揮其無創(chuàng)和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，未來造福人類?？傊庵苎狣NA檢測具有良好的效能，靈敏度和特異性都能滿足現(xiàn)有臨床需求。當(dāng)然臨床上應(yīng)該進(jìn)一步研究更具優(yōu)良的方法[9-12]。