張繼華，李 浩，張媛媛，蘇 靜，薛海濤

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050031)

喉鱗癌是耳鼻咽喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，國際流行病學(xué)調(diào)查顯示，喉癌占頭頸腫瘤的30%～40%，占全身腫瘤的1%～2.5%，T3、T4期喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為40%～65%，同無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉癌患者5年生存率降低約50%[1]，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患癌患者生存率降低的主要因素。目前臨床醫(yī)師主要根據(jù)術(shù)前影像學(xué)檢查資料來間接判斷患者是否存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而決定是否行頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)。但腫瘤早期轉(zhuǎn)移并不能導(dǎo)致相應(yīng)淋巴結(jié)增大等異常表現(xiàn)，因此術(shù)前影像學(xué)檢查并不能為醫(yī)生提供確切的結(jié)果。臨床急需找到一種能準(zhǔn)確而有效判斷患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，為臨床頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的實(shí)施提供客觀依據(jù)。最近研究證實(shí)，染色體分離樣蛋白1(chromosome segregation like 1 protein，CSE1L)在婦科腫瘤、淋巴瘤、結(jié)直腸腫瘤、乳腺腫瘤及肺腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)。CSE1L被認(rèn)為與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。但其在喉癌中的表達(dá)情況尚少見報道。本研究對76例人喉鱗癌患者腫瘤組織及32例腫瘤周圍正常喉黏膜組織中CSE1L蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測，旨在探討CSE1L同人喉鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以為臨床頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷及頸部淋巴結(jié)清掃手術(shù)的實(shí)施提供更可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集并整理2016年1月—2018年12月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的76例住院喉鱗狀細(xì)胞癌患者標(biāo)本及病歷資料(患者術(shù)前均未經(jīng)放化療)，其中診斷聲門上型患者48例，聲門型患者28例；32例癌旁正常喉黏膜組織取自距離腫瘤切緣不小于0.5 cm(病理檢查確認(rèn)無腫瘤細(xì)胞存在)。76例喉鱗癌組織樣本具體情況如下，男性62例，女性14例；年齡32～76歲，平均58歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例(其中6例T1N1M0，5例T1N2M0，8例T2N1M0，9例T2N2M0，7例T3N1M0，2例T3N2M0，2例T4N1M0，0例T4N2M0)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例(其中12例T1N0M0，12例T2N0M0，7例T3N0M0，6例T4N0M0)。臨床分期：17例Ⅰ期,23例Ⅱ期,30例Ⅲ期，6例Ⅳ期。腫瘤分化程度：38例高分化，13例中分化，25例低分化。所有研究樣本均經(jīng)病理科兩位副高以上職稱醫(yī)生確認(rèn)。

1.2主要試劑及儀器設(shè)備 CSE1L免疫組織化學(xué)用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度為1∶85。免疫組織化學(xué)用SP染色試劑盒、DAB顯色用試劑，北京中杉金橋生物公司。倒置顯微鏡X-PC-2型倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)切片 修剪留取組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、固定、石蠟包埋，蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度5 μm，切片稍干后4 ℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2免疫組織化學(xué)指標(biāo)檢測及方法 ①復(fù)溫：于冰箱內(nèi)取出切片，使其溫度上升至室溫。②抗原修復(fù)：將切片置于0.01 mol/L、pH 6.0的檸檬酸緩沖液中，以高溫高壓熱修復(fù)抗原2 min。待其溫度恢復(fù)至室溫后，蒸餾水沖洗兩次，PBS液浸洗5 min。③滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%的雙氧水孵育10 min，蒸餾水沖洗兩次，PBS液浸洗5 min。④加一抗：滴加兔抗人CSE1L多克隆抗體一抗工作液(10 μL/份)，稀釋度分別為1：85，37 ℃孵育1 h，用已知表達(dá)陽性切片做陽性對照，用0.1 mol/L PBS代替一抗作陰性對照。PBS沖洗5 min,共3次。⑤加二抗：滴加PV6001二抗，37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS沖洗5 min,共3次。⑥D(zhuǎn)AB顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色5 min。⑦蘇木素復(fù)染細(xì)胞核(5 min)，再依次經(jīng)過1%酸性酒精分化(30 s)、1%氨水返藍(lán)(1 min)、70%酒精(10 min)、80%酒精(10 min)、90%酒精(10 min)、100%酒精Ⅰ(20 min)、100%酒精Ⅱ(20 min)、二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯漂洗Ⅱ(20 min)、中性樹脂封片。

1.3.3結(jié)果判斷 采用半定量雙評分法，顯微鏡高倍鏡視野下根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例以及細(xì)胞染色強(qiáng)度做綜合判定。表達(dá)強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色，記0分，黃色，記1分，棕黃色，記2分，棕褐色，記3分。陽性細(xì)胞所占視野細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞百分率<25%，記0分；陽性細(xì)胞百分率25%～50%，記1分；陽性細(xì)胞百分率51%～75%，記2分；陽性細(xì)胞百分率>75%，記3分。兩種方法所得評分和，得分0～1為目的蛋白陰性(-)；得分2為目的蛋白弱陽性(+)；得分3～4為目的蛋白陽性(++)，得分5～6為目的蛋白強(qiáng)陽性(+++)。

1.3.4Western法測腫瘤細(xì)胞內(nèi)CSE1L蛋白表達(dá) 參照試劑說明書，提取樣本蛋白，制備Western blot檢測樣品，檢測各組樣品蛋白濃度，常規(guī)上樣，配制選用12%分離膠以及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時設(shè)置Marker預(yù)染蛋白，100 V電泳約1 h 25 min，轉(zhuǎn)膜30 V，0.9 mA過夜。洗膜，定影后進(jìn)行圖象分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)檢測CSE1L蛋白在人喉鱗狀細(xì)胞癌及喉正常黏膜組織中的表達(dá) 39例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CSE1L蛋白陽性表達(dá)率為97%(38/39)；強(qiáng)陽性表達(dá)31例，中等強(qiáng)度表達(dá)6例，弱陽性表達(dá)1例，陰性1例。37例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CSE1L蛋白陽性表達(dá)率為38%(14/37)；強(qiáng)陽性表達(dá)2例，中等強(qiáng)度表達(dá)11例，弱陽性表達(dá)1例，陰性23例。32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標(biāo)本中CSE1L蛋白均為陰性表達(dá)。見圖1。

圖1 CSE1在喉鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)情況(SP ×200)

2.2Western Blot檢測CSE1L蛋白在人喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá) 喉鱗癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CSE1L蛋白表達(dá)明顯高于喉鱗癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041)；喉鱗癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CSE1L蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)。見表1。

表1 CSE1L在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達(dá)情況

2.3CSE1L蛋白表達(dá)與喉鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、原發(fā)部位、臨床分期、病理類型及T分級喉癌組織中CSE1L的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 CSE1L的表達(dá)與喉鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

3 討 論

喉鱗癌是耳鼻咽喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，但由于喉癌的高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，尤其是T3，T4期喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為40%～65%，使的這一部分患者5年生存率明顯降低，同無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉癌患者5年生存率降低約50%[1]，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致喉癌病死率居高不下的主要原因，其中尤以聲門上型及聲門下型患者居多[2]。由于其發(fā)病部位隱匿，多數(shù)患者就診于腫瘤晚期。

目前喉癌臨床治療仍以手術(shù)為主，單側(cè)或雙側(cè)頸淋巴結(jié)清掃術(shù)是T3和T4期腫瘤標(biāo)準(zhǔn)治療方案的一部分。但由于頸部是人體重要神經(jīng)、血管的集中部位，相鄰組織之間的關(guān)系密切，手術(shù)在徹底切除腫瘤的同時，也給患者帶來諸如失聲、吞咽困難、鄰近重要神經(jīng)、血管損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥，而同時行頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，無疑進(jìn)一步加重了對患者的損傷，增加手術(shù)時間及住院時間，進(jìn)一步降低了患者的生活質(zhì)量。目前臨床醫(yī)師主要根據(jù)術(shù)前影像學(xué)評估頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及選擇術(shù)式，但有一定局限性。使得目前頸淋巴結(jié)清掃術(shù)存在一定的盲目性，部分早期轉(zhuǎn)移癌患者未行頸淋巴結(jié)清掃術(shù)，手術(shù)未能徹底切除腫瘤；部分未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者卻進(jìn)行了頸淋巴結(jié)清掃術(shù)，加重了不必要的損傷。因而臨床急需找到一種能準(zhǔn)確而有效判斷患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，為臨床頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的實(shí)施提供客觀依據(jù)。

CSE1L負(fù)責(zé)調(diào)解importin-α從細(xì)胞核中的運(yùn)輸，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)[3-4]。CSE1L可以與細(xì)胞微管和紡錘體相聯(lián)系，通過刺激腫瘤細(xì)胞增殖來促進(jìn)癌癥進(jìn)展。還通過增強(qiáng)腫瘤組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallo proteinase-2,MMP-2)分泌，通過調(diào)節(jié)P53基因的表達(dá)，增加腫瘤侵襲性[5-7]。 因此，在某些癌癥類型中，CSE1L被認(rèn)為與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]。最近研究證實(shí)，CSE1L在婦科腫瘤、淋巴瘤、結(jié)直腸腫瘤、乳腺腫瘤及肺腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)[10-14]。

在頭頸腫瘤方面，有關(guān)CSE1L的研究較少，Wang等[15]研究表明，CSE1L同鼻咽癌患者預(yù)后無關(guān)。然而，Li等[16]報道，CSE1L在鼻咽癌細(xì)胞凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮作用。Wang等[13]報道，CSE1L在區(qū)分伯基特淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中起著重要的作用。因此，有必要對喉鱗癌患者臨床特征同其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系進(jìn)行研究。

本研究通過免疫組織化學(xué)和蛋白印記Western Blot法對人喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常黏膜組織中CSE1L蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測，探討了CSE1L同人喉鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果顯示39例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CSE1L蛋白陽性表達(dá)率分別為97%(38/39)；強(qiáng)陽性表達(dá)31例，中等強(qiáng)度表達(dá)6例，弱陽性表達(dá)1例，陰性1例。37例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CSE1L蛋白陽性表達(dá)率分別為38%(14/37)；強(qiáng)陽性表達(dá)2例，中等強(qiáng)度表達(dá)11例，弱陽性表達(dá)1例，陰性23例。32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標(biāo)本中CSE1L蛋白均為陰性表達(dá)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，喉鱗癌組織中CSE1L的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者喉鱗癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同性別、年齡、原發(fā)部位、臨床分期、病理類型及T分級喉癌組織中CSE1L的陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，CSE1L有可能成為判斷人喉鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生物學(xué)標(biāo)志物。為臨床頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷及頸部淋巴結(jié)清掃手術(shù)的實(shí)施提供更可靠的理論依據(jù)。