程 亮，徐 永

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 淮安 223002；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 淮安 223002)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病(type 2 diabetes milletus,T2DM)最常見的慢性并發(fā)癥，也是導(dǎo)致T2DM患者病死率增加的主要原因之一。DKD早期表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate,GFR)增加，特征是腎小球肥大，腎小球系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)增加；隨著病情的發(fā)展，患者GFR水平逐漸下降，表現(xiàn)為腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜基質(zhì)增生，甚至腎小管萎縮，并最終進(jìn)展為終末期腎臟病(end stage renal disease,EASD)[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，代謝紊亂和血流動(dòng)力學(xué)異常是DKD的主要致病因素[2]。然而，隨著慢性低級(jí)別炎癥狀態(tài)與T2DM之間的關(guān)系被揭示，免疫與炎癥機(jī)制在DKD發(fā)展過程中作用受到了廣泛關(guān)注，T細(xì)胞激活、單核-巨噬細(xì)胞募集、以及釋放炎癥細(xì)胞因子被認(rèn)為參與了DKD的發(fā)生發(fā)展[3]?；诖?，本研究通過檢測T2DM患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群，并分析其與腎功能變化之間的關(guān)系，旨在探討CD4+T細(xì)胞在DKD發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院開展研究受試者招募工作，招募日期為2019年1月—2020年12月。T2DM診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)公布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝、腎功能不全的患者；②合并糖尿病急性并發(fā)癥、感染性疾病、自身免疫性疾病或腫瘤的患者；③近期有創(chuàng)傷或手術(shù)病史的患者；④近3個(gè)月曾接受過全身糖皮質(zhì)激素或其他可能影響免疫系統(tǒng)藥物治療的患者。共有113例T2DM患者納入研究。依據(jù)是否合并DKD，入組T2DM患者被分為兩組，T2DM組和DKD組。DKD診斷參照《糖尿病腎臟病診治專家共識(shí)》，即微量白蛋白尿[尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio，ACR)30～<300 mg/g)]或大量白蛋白尿(ACR≥300 mg/g)或估算腎小球?yàn)V過率(estimate the glomerular filtration rate，eGFR)下降[eGFR<60 mL·min-1·1.73 m-2][4]。T2DM患者中，T2DM組63例，男性25例，女性28例，年齡44～74歲，平均(59.6±12.8)歲；DKD組50例，男性20例，女性30例，年齡46～77歲，平均(60.9±11.9)歲。另外選取30例于2019年1月—2020年12月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院體檢的健康志愿者作為對(duì)照組(NC組)，要求血糖在正常范圍內(nèi)、無T2DM家族史、且無臨床確診疾病。正常對(duì)照組30例，男性13例，女性17例，年齡46～72歲，平均(58.2±10.0)歲。三組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署了書面知情同意書。

1.2研究方法 收集受試者的性別、年齡、身高、體重、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)等人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并計(jì)算體重指數(shù)(body mass index,BMI)。禁食8 h后，留取空腹靜脈血，檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。血糖和血脂采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(HITACHI-7180，日本)，HbA1c采用高效液相色譜分析法檢測(BIO-RAD D-10TM，美國)。eGFR計(jì)算公式為：186×血清肌酐(serum creatinine，SCr)-1.154×(年齡)-0.203×0.742(女性)。BMI計(jì)算公式為：體重(kg)/身高2(m2)。

1.3流式細(xì)胞術(shù)分析 肝素抗凝管采集受試者外周肘靜脈血約5 mL，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。采用FITC-anti-CD4、PE-anti-CD25和APC-anti-FOXP3標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例；采用PerCP-Cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD8和PE-anti-IFN-γ標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)占CD3+T細(xì)胞比例；采用PerCP-Cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD8和PE-anti-IL-4標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測Th2(CD3+CD8-IL-4+)占CD3+T細(xì)胞比例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料的多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，在組間比較時(shí)，方差齊性選擇LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊選擇LSD-t′檢驗(yàn)。CD4+T細(xì)胞亞群與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，并采用多元線性回歸分析確定CD4+T細(xì)胞亞群的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床指標(biāo)及T細(xì)胞亞群的比較 與對(duì)照組比較，T2DM組和DKD組的SBP、FPG、HbA1c和TC水平明顯升高(P<0.05)；且與T2DM組相比，DKD組SBP、HbA1c、SCr和ACR水平明顯升高(P<0.05)，eGFR水平明顯下降(P<0.05)。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，T2DM組和DKD組的外周血Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值明顯升高(P<0.05)，但Tregs細(xì)胞比例卻顯著降低(P<0.05)。而且，與T2DM患者相比，DKD組的外周血Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值升高(P<0.05)，Tregs細(xì)胞比例下降(P<0.05)。見表1。

表1 受試者的基本臨床特征比較

2.2T2DM患者eGFR與外周血CD4+T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 T2DM患者外周血Th1/Th2比值與eGFR呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.211,P=0.025)；Tregs細(xì)胞比例與eGFR呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.276,P=0.003)。

2.3多元線性回歸分析T2DM患者腎功能變化的影響因素 為了明確T2DM患者腎功能變化的影響因素，采用多元逐步回歸分析，以eGFR為因變量，年齡、性別、BMI、SBP、DBP、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Th1、Th2、Th1/Th2比值、以及Tregs為自變量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SBP、Tregs、Th1/Th2比值和TC是T2DM患者eGFR變化的影響因素，回歸方程為eGFR=131.842-0.479×SBP+10.654×Tregs-0.623×Th1/Th2比值+3.169×TC。見表2。

表2 多元逐步回歸分析新診斷T2DM患者eGFR的影響因素

3 討 論

DKD是一種由多種因素共同作用導(dǎo)致的慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)，特征為持續(xù)性蛋白尿和腎功能進(jìn)行性下降。在此過程中，腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system,RAAS)激活導(dǎo)致腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常被認(rèn)為是DKD的主要致病因素[5]。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腎臟組織中單核巨噬細(xì)胞募集和T淋巴細(xì)胞激活，并釋放炎癥細(xì)胞因子參與了DKD的發(fā)病過程[6]。一方面，長期高血糖可以導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)蓄積，并與淋巴細(xì)胞發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞激活和釋放炎癥介質(zhì)[7]。另一方面，RAAS激活和內(nèi)皮細(xì)胞損傷是淋巴細(xì)胞活化增殖和炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[8]。

T淋巴細(xì)胞可以被分為CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，分別識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類和Ⅰ類分子遞呈的肽類分子。根據(jù)功能與細(xì)胞因子分泌情況，CD4+T細(xì)胞可被分為促炎的Th1和Th17，以及抗炎的Th2和Tregs。一旦被激活，Th1和Th2可以表現(xiàn)出多種炎癥跡象，包括釋放大量的細(xì)胞因子。Th1能夠分泌干擾素γ(interferon-γ,INF-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)2和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，并觸發(fā)細(xì)胞免疫和吞噬細(xì)胞依賴性炎癥反應(yīng)；Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13,主要調(diào)節(jié)抗體反應(yīng)。相比之下，Tregs是一類主要發(fā)揮免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，通過細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖，并表達(dá)IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β等細(xì)胞因子抑制Th1、Th2和Th17等細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)[9]。本研究中，與對(duì)照組相比，T2DM患者外周血Th1細(xì)胞比例升高，Tregs細(xì)胞比例下降，且Th1/Th2細(xì)胞比值明顯升高。這些結(jié)果與既往研究結(jié)果相符，提示T2DM患者體內(nèi)Tregs細(xì)胞免疫抑制功能下降，Th1、Th2等效應(yīng)T細(xì)胞被激活并參與免疫應(yīng)答，促進(jìn)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生。將T2DM患者進(jìn)一步分為T2DM組和DKD組后，與T2DM患者相比，DKD組的外周血Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2比值進(jìn)一步升高升高，Tregs細(xì)胞比例進(jìn)一步下降。而且，Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，T2DM患者外周血Th1/Th2比值與eGFR呈負(fù)相關(guān)關(guān)系； Tregs細(xì)胞比例與eGFR呈正相關(guān)關(guān)系。多元逐步回歸分析提示Tregs和Th1/Th2是T2DM患者eGFR變化的影響因素。這些研究結(jié)果提示，T2DM患者體內(nèi)存在CD4+T穩(wěn)態(tài)失衡，CD4+T細(xì)胞亞群向促炎方向極化，并與T2DM患者腎功能下降密切相關(guān)。

既往研究顯示，DKD患者腎活檢標(biāo)本中存在CD4+T細(xì)胞浸潤，并與腎功能下降密切相關(guān)，提示CD4+T細(xì)胞浸潤與T2DM患者腎臟損傷和DKD進(jìn)展有關(guān)[10]?；罨腡細(xì)胞可以通過細(xì)胞毒作用直接損傷腎臟組織，并可以刺激系膜細(xì)胞分泌集落刺激因子1(colony stimulating factor,CSF-1)和單核細(xì)胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)間接導(dǎo)致腎損傷[11]。T細(xì)胞表達(dá)AGEs受體，與AGEs結(jié)合后被激活，IFN-γ合成和分泌增加，加重腎臟組織的免疫炎癥損傷[12]。T2DM患者體內(nèi)Th1細(xì)胞在腎小球歸巢與細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICMA-1)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和P選擇素水平升高有關(guān)，這些細(xì)胞因子可以引起進(jìn)一步的腎損傷[13]。而且，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CKD大鼠血清中Th1細(xì)胞比例升高，Tregs比例下降，且腎組織中IFN-γ、TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降[14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞相關(guān)炎癥因子在CKD患者腎臟組織損傷中發(fā)揮重要作用，包括IFN-γ和IL-2等[15]。

綜上所述，DKD患者體內(nèi)存在CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞亞群向促炎方向極化，外周血促炎Th1表達(dá)升高，抗炎Tregs表達(dá)下降。而且，T2DM患者外周血CD4+T細(xì)胞異常與eGFR水平下降密切相關(guān)，提示CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡或參與了DKD發(fā)生發(fā)展。