馬劍 ，陳智玲 ，張宏志 ，李志強(qiáng) ，王愈 ，孟超 ，馬艷弘 *

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；4.徐州世緣食品有限公司，江蘇 徐州 221000）

梨（Pyrus spp），被子植物門雙子葉植物綱薔薇科蘋果亞科梨屬植物，其汁液豐富、口感香甜，富含氨基酸、維生素、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、多酚、膳食纖維等多種營養(yǎng)物質(zhì)與活性成分［1，2］，具有止渴生津、抗菌消炎、潤腸通便等生物活性功能［3］。中國是全球最大的梨果產(chǎn)地，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，其產(chǎn)量位居世界首位，占全球總產(chǎn)量的60%以上，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景極其廣闊［2］。

梨汁是最主要的梨加工產(chǎn)品，具有良好的天然風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)價值［4］，但由于梨汁存在易褐變［5］、含糖量高、儲藏期短等弊端，嚴(yán)重影響相關(guān)產(chǎn)品的感官品質(zhì)、功能特性和市場銷售［6，7］。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指能以碳水化合物為原料產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌，其調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇等健康功效已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛認(rèn)可。乳酸菌發(fā)酵果蔬汁不僅有利于產(chǎn)品保持更好的色澤、口感、風(fēng)味和保質(zhì)期［8~11］，顯著降低果汁中的糖含量，有效釋放和提高產(chǎn)品中總酚、黃酮、膳食纖維等生物活性物質(zhì)的含量［12，13］，以及醛類、醇類、酯類等風(fēng)味有機(jī)化合物的含量［13，14］，還能夠提高金屬離子絡(luò)合活性、增強(qiáng)抗氧化能力，顯著抑制酶促褐變［15，16］。因此，乳酸菌發(fā)酵果蔬汁已經(jīng)成為食品加工領(lǐng)域最受關(guān)注的益生菌飲品。

本研究以梨汁為原料，利用乳酸菌復(fù)合菌種發(fā)酵技術(shù)制備功能性梨汁飲品，研究發(fā)酵過程中理化指標(biāo)、營養(yǎng)與功能成分、抑菌及抗氧化活性的變化規(guī)律，為提高梨果深加工途徑提供技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮梨果，由徐州世緣食品有限公司提供。

菌種：植物乳桿菌 SD2（CGMCC No.13241）、FM-LP-9（CGMCC No.16701）由本研究室分離鑒定并保存。

果漿酶、果膠酶，購自諾維信生物技術(shù)有限公司；DPPH，上海源葉生物科技有限公司；ABTS 自由基，購自南京建成生物工程研究所；苯酚、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸（均為分析純）等，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，購于上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D-8 型紫外可見分光光度計，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；pH 酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；JJ500 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16B 臺式離心機(jī)；上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 工藝流程

梨→清洗、切分→打漿→酶解→過濾→調(diào)節(jié)糖度→滅菌→接種→發(fā)酵→離心過濾→灌裝→殺菌→成品

1.4 操作要點(diǎn)

1.4.1 梨汁制備

梨果清洗干凈切塊，按1∶1 的質(zhì)量比加入0.15%的檸檬酸水溶液打漿，用NaOH 溶液將梨汁 pH 調(diào) 節(jié) 為 5.0~5.5；加入 0.2% 果 膠酶 和0.25%果漿復(fù)合酶制劑，45 ℃保溫酶解2 h，酶解結(jié)束后 90 ℃滅酶活 5 min，冷卻，4 500 r·min-1離心15 min，上清液分裝于錐形瓶中密封，加熱至85 ℃條件下巴氏殺菌30 min，4 ℃冷藏備用。

1.4.2 發(fā)酵劑的活化

將?20 ℃冷凍保藏的植物乳桿菌SD-2 和FM-LP-9 甘油管解凍至室溫，在無菌條件下按2.5%的接種量分別接種在MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)18~24 h，然后將2 種菌發(fā)酵液按照2∶1 體積比混合，3 500 r·min-1離心 10 min，棄去上清，沉淀用等體積無菌生理鹽水重懸，制得復(fù)合發(fā)酵劑，備用。

1.4.3 梨汁乳酸菌發(fā)酵

按照2.5%的接種量將發(fā)酵劑接入制備好的梨汁中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。每隔 6 h 取樣，離心分離后取上清測定相應(yīng)指標(biāo)。

1.5 理化指標(biāo)及抗氧化活性測定

1.5.1 理化指標(biāo)

pH 值采用pH 計測定；總酸含量的測定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》的方法測定。乳酸菌菌落總數(shù)采用平板計數(shù)法測定；可溶性固形物含量使用手持糖度儀測定；還原糖的測定采用3，5-二硝基水楊酸法；總酚含量的測定采用福林-酚法，以沒食子酸為對照品，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.5.2 體外抗氧化活性的測定

（1） DPPH 自由基清除率的測定

參照馬艷弘等［17］的方法，取不同發(fā)酵時段的發(fā)酵上清液取2 mL 于刻度試管，每管加2×10-4mol·L-1DPPH 溶 液 2 mL，搖 勻 后 避 光 放 置 30 min，取上清液，測定517 nm 波長處的吸光度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對照組、實(shí)驗(yàn)組。DPPH 自由基清除率計算見如下公式：

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

（2） 羥基自由基清除能力的測定［18］

取不同發(fā)酵時段的發(fā)酵上清液取1 mL 于刻度 試 管 中 ，再 加 入 9 mmol·L-1FeSO4溶 液 、8.8 mmol·L-1H2O2溶液各 1 mL，靜置 10 min 后加入 9 mmol·L-1水楊酸溶液 1 mL，37 ℃水浴下避光反應(yīng)30 min，在510 nm 波長處測定吸光度，羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

（3） ABTS 自由基清除能力的測定［19］

取0.2 mL 發(fā)酵液加入刻度試管中，加入3.8 mL 工作液（將 0.89 mL 2.6 mmol·L-1的 K2S2O8溶液 與 50 mL 7.4mmol·L-1的 ABTS 自 由 基 溶 液 混勻，4 ℃靜置 12~16 h 后使用，使用前用 0.2 mol·L-1pH=7.4 PBS 緩沖溶液稀釋 30 倍），在 50 ℃水浴環(huán)境中暗反應(yīng)10 min，于734 nm 測吸光度。ABTS 自由基清除能力公式如下：

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均是3 次重復(fù)的平均值并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用 SPSS 13.0 軟件和 Origin Pro 8.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨汁發(fā)酵過程中pH、總酸含量的變化

pH 值和總酸是判斷發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，其高低反映發(fā)酵過程是否正常，還能直接影響產(chǎn)品的口感、風(fēng)味、品質(zhì)、以及保質(zhì)期［5］。由圖 1 所示，梨汁發(fā)酵過程中，由于梨本身富含的檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸的溶出［2］以及乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液pH 值不斷降低和總酸含量持續(xù)增加。發(fā)酵24 h 內(nèi)，隨著時間的延長，pH 值快速下降，乳酸不斷積累，發(fā)酵36 h 時pH 降至3.72，總酸含量升至 3.32 g·100 mL-1，36 h 之后，pH 與總酸變化均趨于平緩。

圖1 發(fā)酵過程中pH 和總酸的變化Fig.1 Changes in pH value and total acid during fermentation

2.2 梨汁發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)的變化

乳酸菌是形成發(fā)酵制品營養(yǎng)價值和風(fēng)味特色的決定性因素［20］。檢測梨汁發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)的變化，如圖2 所示，在發(fā)酵起始階段（前6 h），由于乳酸菌需要適應(yīng)新的環(huán)境條件，其生長相對緩慢，6 h 之后乳酸菌進(jìn)入對數(shù)生長期，到24 h 時其菌數(shù)高達(dá) 10.56 log（CFU·mL-1），24 h 之后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及發(fā)酵液pH 的快速下降，乳酸菌生長受到抑制，最終進(jìn)入衰亡期。

圖2 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)的變化Fig.2 Variation of the number of lactic acid bacteria during fermentation

2.3 梨汁發(fā)酵中可溶性固形物和還原糖的變化

如圖3 所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，可溶性固形物含量快速下降，到24 h 時發(fā)酵液可溶性固形物含量為 6.35 °Brix，與發(fā)酵前（11.24 °Brix）相比下降了43.51%。24 h 之后，可溶性固形物含量下降速度減緩，到30 h 之后趨于平緩。還原糖在發(fā)酵初期略微上升，6 h 之后，還原糖濃度快速下降，到發(fā)酵42 h 時還原糖濃度降至3.36%，36 h 時之后還原糖變化趨于平緩。這是由于在發(fā)酵初期，乳酸菌在自身酶系作用下將梨汁中的多糖降解，造成發(fā)酵液中還原糖含量的小幅上升，之后由于乳酸菌活動增強(qiáng)，乳酸菌利用還原糖進(jìn)行生長代謝生成乳酸及其他代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致還原糖和可溶性固形物持續(xù)減少，最終趨于平衡。

圖3 發(fā)酵過程中可溶性固形物和還原糖的變化Fig.3 Variation of soluble solid and reducing sugar in pear juice during fermentation

2.4 梨汁發(fā)酵過程中總酚和中黃酮含量的變化

如圖4 所示，黃酮含量在發(fā)酵初期（≤6 h）略微下降，發(fā)酵6 h 時，梨汁黃酮含量比發(fā)酵前下降了8.46%，6~24 h 之內(nèi)，黃酮含量呈上升趨勢，到發(fā)酵 24 h 達(dá)到最高（164.36 mg·L-1），比發(fā)酵前提高了13.08%，發(fā)酵24 h 之后黃酮含量下降，逐漸平緩。在30 h 之內(nèi)，梨汁中總酚含量隨發(fā)酵時間的延長而增加，發(fā)酵30 h 時其含量達(dá)138.6 mg·L-1，比發(fā)酵前提高了31.13%，30 h 之后總酚含量略微下降，逐漸平緩?？梢?，適宜條件的乳酸菌發(fā)酵不僅能顯著降低梨汁糖度，還有利于提高黃酮、總酚等生物活性成分的含量。這可能是由于乳酸菌代謝產(chǎn)生的酶類及其他代謝產(chǎn)物促進(jìn)了原料中酚類、黃酮物質(zhì)的釋放、溶出和轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的。

圖4 發(fā)酵過程中總酚和黃酮含量的變化Fig.4 Variation of total phenols and total flavonoids in pear juice during fermentation

2.5 梨汁發(fā)酵過程中體外抑菌活性的變化

由圖5 可見，梨汁發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較強(qiáng)的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。隨著發(fā)酵時間的延長，梨汁發(fā)酵液的抗菌能力逐漸增強(qiáng)，發(fā)酵24 h 時達(dá)到最大，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌圈分別為16.5、9.78、12.17 mm，分別比發(fā)酵前增大了113%、26.03%、68.33%。這可能是由于發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、有機(jī)酸、細(xì)菌素、多酚類化合物協(xié)同作用抑制了有害菌的生長。24 h 后其抑菌能力變化不大，基本趨于穩(wěn)定。

圖5 發(fā)酵過程中抗菌活力的變化Fig.5 Variation of antibacterial activity in pear juice during fermentation

2.6 梨汁發(fā)酵過程中體外抗氧化活性的變化

如圖6 所示，梨汁發(fā)酵液對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥自由基的都有一定的清除能力，且在發(fā)酵過程中3 種自由基清除能力均隨著發(fā)酵時間延長而增強(qiáng)，發(fā)酵液對ABTS 自由基的清除活力最高，對羥自由基的清除活力最低。發(fā)酵30 h時，ABTS 自由基、DPPH 自由基、羥自由基的清除能力分別為94.77%、88.76%、65.6%，與發(fā)酵前相比，分別提高了92.96%、106.02%、191.52%。發(fā)酵30 h 后，梨汁乳酸菌發(fā)酵液自由基清除能力趨于穩(wěn)定。

圖6 發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化Fig.6 Variation of the antioxidant capacity during fermentation

3 討論

梨果含水量高達(dá)80%，其保質(zhì)期只有5~6 d，是一種高腐性水果，將其加工制備成為梨汁是解決梨果儲藏的重要技術(shù)手段，其表皮中含有大量多酚化合物，并且是梨果香氣的重要來源。梨汁能夠保留原果的香氣且富含多種酚類化合物，表現(xiàn)出多種有益健康的特征功能。

功能性食品特指醫(yī)學(xué)和食用的特征中間體，具有高價值的健康預(yù)防能力，是正常食物的一部分。乳酸菌發(fā)酵是制備功能性食品常用技術(shù)，使用乳酸菌發(fā)酵加工梨汁是一種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的技術(shù)手段。乳酸菌代謝過程中會產(chǎn)生強(qiáng)抗氧化性的代謝產(chǎn)物，增強(qiáng)產(chǎn)品的生物活性功能。通過乳酸菌微生物發(fā)酵制備的飲料具有比單一水果飲料更大的抗氧化能力和生物活性。

乳酸菌發(fā)酵梨汁是梨汁深加工的新思路，能夠提高梨汁產(chǎn)品的生物活性物質(zhì)，且通過乳酸菌發(fā)酵可生產(chǎn)具有市場價值的梨汁副產(chǎn)品市場，對梨果的生產(chǎn)、加工、儲藏均有重大意義。乳酸菌在生長過程會消耗大量的糖，發(fā)酵0~24 h 時，乳酸菌活菌數(shù)迅速上升，處于對數(shù)生長期，可溶性固形物含量保持下降，且在代謝過程中產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，同時將梨汁中的結(jié)合酚轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酚，使得發(fā)酵液總酸、多酚、黃酮指標(biāo)含量上升，有機(jī)酸含量的增加會增強(qiáng)發(fā)酵液抑菌活性和抗氧化能力；24 h之后，乳酸菌生長進(jìn)入靜止期，各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢變緩，直至發(fā)酵結(jié)束。梨汁經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，糖度迅速降低，可適宜糖年病人食用；有機(jī)酸含量和種類的增加，可改善梨汁風(fēng)味、抑制產(chǎn)品褐變、提升抑菌活性和抗氧化能力，延長儲藏期和貨架期；食用乳酸菌可以促進(jìn)腸道健康，乳酸菌可定殖在腸道細(xì)胞表面，抑制病原菌生長，保持腸道健康。

4 結(jié)論

本研究以梨汁為原料，通過乳酸菌植物乳桿菌SD2、FM-LP-9 復(fù)合發(fā)酵技術(shù)制備發(fā)酵梨汁。梨汁發(fā)酵過程中pH、可溶性固形物、還原糖含量不斷降低，總酸、總黃酮、總酚含量不斷升高，發(fā)酵液的抑菌活性、抗氧化活性升高。發(fā)酵24~30 h 時，pH、總酸、可溶性固形物、還原糖變化逐漸趨于平緩；發(fā)酵24 h 時乳酸菌菌落總數(shù)、總黃酮達(dá)最高，分別為 10.56 log（CFU·mL-1）、164.36 mg·L-1，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌圈比發(fā)酵前增大了113%、26.03%、68.33%；發(fā)酵30 h 時 總 酚 含 量 達(dá) 到 最 高（138.6 mg·L-1），對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基清除率比發(fā)酵前提高了92.96%、106.02%、191.52%。

復(fù)合乳酸菌發(fā)酵梨汁不僅含糖量低、總黃酮和總酚含量高，還具有較強(qiáng)的抑菌活性和抗氧化活性，是一種極具市場開發(fā)前景的益生菌功能飲品，為梨產(chǎn)品深加工拓展思路。