趙寶山 孫光蕊 張志民 張 旭 辛國(guó)華 梁宗英

全世界范圍內(nèi)原發(fā)肺腺癌的發(fā)生率逐年遞增，已超過(guò)鱗癌成為肺癌的最常見(jiàn)病理類型[1]。醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使得肺癌患者的整體生存率雖有所提高，但仍然很低[2]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是目前公認(rèn)的與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切的基因之一。EGFR能啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，并使腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移凋亡等功能發(fā)生明顯變化[3,4]。表觀遺傳學(xué)中的甲基化修飾在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起到十分關(guān)鍵的作用，異常甲基化修飾會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的功能改變，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn)，SPG20基因異常甲基化與結(jié)直腸癌、肝癌和胃癌之間存在密切關(guān)系，并作為早期事件[5,6]。本研究通過(guò)檢測(cè)肺腺癌組織內(nèi)SPG20甲基化及EGFR水平，探討二者在肺腺癌發(fā)生過(guò)程中的相關(guān)性，以期為肺腺癌的病理生理機(jī)制研究和臨床治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1.標(biāo)本:選取2019年1月～2020年10月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科原發(fā)肺腺癌手術(shù)患者70例；術(shù)前均未進(jìn)行任何治療。實(shí)驗(yàn)組為腺癌組織，對(duì)照組為正常肺組織(距癌組織邊緣>6cm)。其中男性17例，女性53例；≥60歲27例，<60歲43例；吸煙患者12例，不吸煙患者58例；按照IASLC第8版制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期37例，Ⅱ期26例，Ⅲ期7例；組織學(xué)分級(jí)：高分化8例，中分化57例，低分化5例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。本研究經(jīng)過(guò)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

2.主要試劑：甲基化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；焦磷酸測(cè)序試劑購(gòu)自美國(guó)CST公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物有限公司；EGFR抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。甲基化引物(華大基因合成)：上游引物：5′-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3′；下游引物：5′-CCCCTCAAAATTAAACAACCTTTCTCTACA-3′。

3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)法檢測(cè)甲基化：提取DNA，以重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。低溫保存?zhèn)溆?。甲基化的反?yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，50℃退火，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸7min。應(yīng)用Pyrose Quencing軟件分析甲基化狀態(tài)。4個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化改變平均值作為甲基化結(jié)果，以遠(yuǎn)癌正常肺組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。(2)免疫組織化學(xué)(SP)：石蠟組織切片脫蠟。3%甲醇-H2O2溶液及枸櫞酸鈉緩沖液加熱處理組織切片。非免疫山羊血清封閉，加一抗，孵育60min，加入二抗；PBS處理后，加入鏈親和素-過(guò)氧化物酶工作液；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，樹(shù)膠封片固定。(3)免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)細(xì)胞膜、胞質(zhì)染色程度和著色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行評(píng)價(jià)計(jì)分(每張切片高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野)；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(A)：無(wú)色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)。著色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(B)：1分(陽(yáng)性細(xì)胞≤10%)，2分(陽(yáng)性細(xì)胞>10%～50%)，3分(陽(yáng)性細(xì)胞>50%～75%)，4分(陽(yáng)性細(xì)胞>75%)。以A+B所得分?jǐn)?shù)作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：0～2分為陰性，3～-4分為陽(yáng)性，5～7分為強(qiáng)陽(yáng)性。(4)Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取蛋白，測(cè)定濃度；常規(guī)制備電泳蛋白上樣液，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，4℃，90V 60～80min轉(zhuǎn)膜。加一抗4℃過(guò)夜。次日孵育二抗，重復(fù)洗膜3次。

結(jié) 果

1.SPG20甲基化水平：詳見(jiàn)表1。

表1 SPG20在腺癌組織和正常肺組織中的甲基化水平

2.EGFR、SPG20蛋白表達(dá)水平(SP法)：在腺癌組織中EGFR基因陽(yáng)性表達(dá)為72.86%，顯著高于正常肺組織的表達(dá)(18.57%)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SPG20在腺癌組織中陽(yáng)性率為31.43%，低于正常肺組織(77.14%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1和表2。

表2 EGFR和SPG20在腺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)水平

圖1 EGFR和SPG20在腺癌組織及正常肺組織中的表達(dá)(HE，×200)A.EGFR腺癌組織中陽(yáng)性；B.EGFR正常肺組織中陰性;C.SPG20腺癌組織中陰性;D.SPG20正常肺組織中陽(yáng)性

3.EGFR、SPG20蛋白表達(dá)水平(Western blot法)：EGFR在腺癌組織中表達(dá)為76.38%±2.67%，高于正常肺組織23.14%±1.86%(圖2)；SPG20在腺癌組織中表達(dá)為18.42%±1.34%，高于正常肺組織65.75%±2.47%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3。

圖2 EGFR在腺癌組織及正常肺組織中表達(dá)水平與腺癌組織比較，*P<0.05

圖3 SPG20在腺癌組織及正常肺組織中表達(dá)水平與腺癌組織比較，*P<0.05

4.SPG20甲基化與EGFR相關(guān)性:SPG20甲基化和EGFR表達(dá)相關(guān)系數(shù)為r=1.00，χ2=6.37 (P<0.05),二者具有相關(guān)性，詳見(jiàn)表3。

表3 在腺癌組織中SPG20甲基化與EGFR表達(dá)相關(guān)性(n)

5.肺腺癌組織SPG20甲基化、EGFR與臨床病例特點(diǎn)的相關(guān)性：SPG20甲基化及EGFR均與肺腺癌TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)；與患者性別、年齡和吸煙與否無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表4。

表4 SPG20甲基化和EGFR與臨床病例特點(diǎn)的相關(guān)性

討 論

肺腺癌是肺癌的常見(jiàn)病理類型，其發(fā)生率逐年遞增，已成為肺癌最常見(jiàn)的病理類型，且發(fā)病年齡的年輕化趨勢(shì)愈加明顯[7,8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展是涉及多個(gè)基因、多個(gè)階段、多個(gè)因素共同作用的結(jié)果[9]。目前肺腺癌的基因靶向治療雖取得了一定的進(jìn)展，但肺腺癌患者預(yù)后仍有待進(jìn)一步提高。因此，提高肺腺癌早期診斷率、發(fā)現(xiàn)評(píng)估預(yù)后新指標(biāo)和抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)至關(guān)重要[10,11]。

表觀遺傳學(xué)中甲基化修飾是惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制之一，參與多種人體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。研究證實(shí),DNA甲基化修飾的紊亂狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)異常而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化最終發(fā)生腫瘤[13]。DNA甲基化在腫瘤中作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)甲基化造成基因突變[14]。(2)甲基化夠阻止基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致抑癌基因低表達(dá)甚至不表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[15]。(3)癌基因甲基化水平降低而活化癌基因?qū)е履[瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[16]。(4)基因組的低甲基化和部分癌基因啟動(dòng)子低甲基化而導(dǎo)致腫瘤惡性程度的增加。研究發(fā)現(xiàn)，基因的甲基化狀態(tài)與腫瘤組織分型、分級(jí)和病理分期密切相關(guān),是腫瘤早期診斷和患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤相關(guān)因子SPG20在肺腺癌組織中發(fā)生了甲基化，且呈高甲基化狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，SPG20高甲基化狀態(tài)與肺腺癌TNM分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究結(jié)果提示，SPG20的甲基化可能參與了肺腺癌的發(fā)生，并促進(jìn)了其進(jìn)一步的發(fā)展。

SPG20基因編碼Spartin多功能蛋白，參與人體多種疾病包括腫瘤的發(fā)生。研究表明，SPG20基因發(fā)生甲基化會(huì)造成基因表達(dá)抑制或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致Spartin蛋白減少或缺失。SPG20在細(xì)胞分裂周期的異常作用與腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性。更有研究表明，SPG20與EGFR的降解有關(guān)，影響該受體的胞吞及運(yùn)輸作用。SPG20啟動(dòng)子甲基化在卵巢癌中的作用已經(jīng)被證實(shí)，并提出作為前列腺癌的全基因組甲基化分析目標(biāo)[18]。在乳腺癌、前列腺癌及肝癌中通過(guò)外源性干預(yù)甲基干預(yù)某些關(guān)鍵癌基因DNA，實(shí)現(xiàn)了抑制這些癌基因的過(guò)表達(dá),進(jìn)而抑制該腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[19～21]。本研究顯示，在肺腺癌組織中SPG20的蛋白表達(dá)明顯低于正常肺組織，筆者分析，SPG20在癌組織中的低表達(dá)可能是因?yàn)榉蜗侔┙M織中SPG20的高甲基化狀態(tài)抑制了SPG20的基因轉(zhuǎn)錄，使其在組織中表達(dá)下降，進(jìn)而促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生。

表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的作用。EGFR突變?cè)斐善涔δ苋笔Щ蚱湎嚓P(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的活性異常會(huì)引起腫瘤的發(fā)生。研究表明，EGFR與人體內(nèi)多種實(shí)體腫瘤的血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究免疫組化檢測(cè)肺腺癌中EGFR的結(jié)果顯示，EGFR在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織，進(jìn)一步通過(guò)蛋白免疫印跡方法定量檢測(cè)EGFR表達(dá)量。EGFR在癌組織中高表達(dá)，與正常組織表達(dá)量存在明顯差異，說(shuō)明肺腺癌的發(fā)生與EGFR之間存在密切的相關(guān)性。

通過(guò)分析EGFR與肺腺癌患者臨床病例特征的相關(guān)性結(jié)果顯示，EGFR的表達(dá)水平與肺腺癌TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；SPG20甲基化和EGFR的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，癌組織中SPG20高甲基化組織中EGFR亦高表達(dá)，二者呈正相關(guān)。筆者分析，SPG20作為“抑癌因子”在肺腺癌組織內(nèi)發(fā)生了甲基化，使其基因表達(dá)受到抑制，進(jìn)而可能促進(jìn)了作為“促癌因子”的EGFR在癌組織中的高表達(dá)，最終促進(jìn)了肺腺癌的惡性程度增強(qiáng),導(dǎo)致其容易通過(guò)淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，降低了患者的生存率。

基于上述理論及研究結(jié)果，SPG20甲基化及EGFR與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚不明確。今后研究中將以SPG20甲基化為切入點(diǎn)，結(jié)合EGFR研究為重點(diǎn),對(duì)其促癌機(jī)制進(jìn)行深入研究。對(duì)DNA異常甲基化的研究可以更加深入地了解到惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制,為今后早期診治、預(yù)后判斷等提供更為可靠的依據(jù)。